超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定木瓜中聯(lián)苯肼酯及其代謝產(chǎn)物

張 月，韓丙軍，趙方方（中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測(cè)試中心，海南省熱帶果蔬產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 海口　5711 01）

超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定木瓜中聯(lián)苯肼酯及其代謝產(chǎn)物

張 月，韓丙軍，趙方方
（中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測(cè)試中心，海南省熱帶果蔬產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 海口5711 01）

建立木瓜中聯(lián)苯肼酯及其代謝產(chǎn)物聯(lián)苯肼酯烯的超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜分析方法。樣品用乙腈和0.25%乙酸溶液勻漿提取，鹽析，分取上清液，同時(shí)加入0.25%抗壞血酸溶液于離心管中，衍生60 min后待測(cè)。目標(biāo)化合物經(jīng)Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）分離，采用三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行定性定量分析。結(jié)果表明，在1.0～10.0 ng/kg添加量時(shí)，聯(lián)苯肼酯及聯(lián)苯肼酯烯的回收率分別為86.2%～109.8%和78.3%～97.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為4.0%～7.0%和4.5%～8.8%（n=5）。方法的 線性范圍為0.25～2.0 ng/m L，相 關(guān)系數(shù)（r）為0.99 9 8。該方法對(duì)聯(lián)苯肼酯的定量限均為1×10－6mg/kg，能滿(mǎn)足木瓜中聯(lián)苯肼酯的殘留檢測(cè)要求。

超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜；木瓜；聯(lián)苯肼酯；聯(lián)苯肼酯烯；殘留

聯(lián)苯肼酯是聯(lián)苯肼類(lèi)殺螨劑，是一種新型選 擇性殺螨劑。其純品外觀為白色固體結(jié)晶。美國(guó)科聚亞公司2008年在我國(guó)獲得登記。其作用機(jī)理為對(duì)螨類(lèi)的中樞神經(jīng)傳導(dǎo)系統(tǒng)的γ-氨基丁酸受體的獨(dú)特作用，也有研究表明聯(lián)苯肼酯作用于螨類(lèi)線粒體，抑制細(xì)胞色素bQo位點(diǎn)復(fù)合物Ⅲ的合成，具有殺卵活性和對(duì)成螨的擊倒活性，且持效期長(zhǎng)［1-8］。主要用于果樹(shù)、棉花、蔬菜和茶葉上害螨的防治［9］，很多國(guó)家和地區(qū)在不同作物上均制定了不同的殘留限量標(biāo)準(zhǔn)，其中美國(guó)［10］為0.05～15 mg/kg，加拿大［10］為0.01～1.5 mg/kg，澳大利亞［10］為0.01～2 mg/kg，歐盟［11］為0.01～2 mg/kg，日本［12］為0.01～10 mg/kg。根據(jù)2006年聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織及世界衛(wèi)生組織農(nóng)藥殘留聯(lián)合專(zhuān)家會(huì)議報(bào)告［13］中 的殘留定義為聯(lián)苯肼酯及其代謝產(chǎn)物聯(lián)苯肼酯烯之和，聯(lián)苯肼酯烯以聯(lián)苯肼酯計(jì)，因此檢測(cè)聯(lián)苯肼酯及其代謝產(chǎn)物具有重要的意義。

近年來(lái)有關(guān)聯(lián)苯肼酯的文獻(xiàn)報(bào)道大多是關(guān)于牛奶、葡萄酒、干花、濃縮果蔬汁、草莓、柑橘等中聯(lián)苯肼酯的殘留分析研究［14-20］。曹巍等［21］采用高效液相色譜分析聯(lián)苯肼酯原藥，肖崢［22］、張燕［23］等采用高效液相色譜法對(duì)聯(lián)苯肼酯懸浮劑含量的測(cè)定，未見(jiàn)其在木瓜中殘留檢測(cè)的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜電噴霧正離子模式檢測(cè)，建立了木瓜中 聯(lián)苯肼酯及其代謝產(chǎn)物聯(lián)苯肼酯烯的殘留檢測(cè)，結(jié)果滿(mǎn)足農(nóng)藥殘留檢測(cè)的要求［24］。

1　　材料與方法

1.1材料、試劑與儀器

木瓜鮮果，采于海南省臨高縣國(guó)營(yíng)紅華農(nóng)場(chǎng)，樣品采集時(shí)間為2014年7月，樣品分裝后在－20 ℃冷凍貯藏。

聯(lián)苯肼酯及聯(lián)苯肼酯烯標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%）農(nóng)業(yè)部環(huán)境質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心（天津）；乙腈（色譜極）美國(guó)Fisher公司；抗壞血酸、乙酸（分析純）廣州化學(xué)試劑廠。

超高效液相色譜儀美國(guó)Waters公司；API4000+三重四極桿質(zhì)譜儀美國(guó)AB公司；IKAT25勻漿機(jī)上海萬(wàn)捷科技有限公司；HH-6恒溫水浴鍋常州賽普實(shí)驗(yàn)儀器廠。

1.2方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別準(zhǔn)確稱(chēng)取0.050 g（精確至0.001 g）聯(lián)苯肼酯及聯(lián)苯肼酯烯標(biāo)準(zhǔn)品于2 個(gè)50 mL容量瓶中，乙腈溶解并定容，得到1 000 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于－18 ℃保存。

基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液：按樣品前處理方法將空白樣品（未有目標(biāo)農(nóng)藥檢出的樣品）制成聯(lián)苯肼酯基質(zhì)溶液，用基質(zhì)溶液稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液制備成所需的定量標(biāo)準(zhǔn)溶液，臨用現(xiàn)配。

1.2.2樣品前處理

供試木瓜采自海南島（經(jīng)測(cè)定不含目標(biāo)化合物）。取全果樣品采用四分法縮分，用食品料理機(jī)攪碎，混勻，留250 g樣品。分別準(zhǔn)確稱(chēng)取樣品5.00 g（精確至0.01 g）于50 mL離心管中，分別加入5.0 mL 0.25 %乙酸溶液和10.0 mL乙腈，提取過(guò)程依據(jù)NY/T 761—2008《蔬菜和水果中有機(jī)磷、有機(jī)氯、擬除蟲(chóng)菊酯和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥多殘留的測(cè)定》［25］標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行。分取5 mL上層清液于15 mL離心管中，分別加入5 mL 0.25 %抗壞血酸于離心管中，充分混勻，于50 ℃水浴中衍生60 min，冷卻，充分混勻，于40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮，用乙腈定容至5 mL，上機(jī)待測(cè)。

1.2.3色譜條件

Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流速0.30 mL/min；流動(dòng)相乙腈-水，洗脫梯度見(jiàn)表1；進(jìn)樣量2 μL。

表1　梯度洗脫條件Table 1　Gradient elution parameterss

1.2.4質(zhì)譜條件

電噴霧正離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行檢測(cè)。碰撞氣（氮?dú)猓毫Γ?mtorr；氣簾氣壓力：137.9 kPa；霧化氣壓力：344.75 kPa；噴霧電壓：4 500 V；離子源溫度：600.0 ℃。選擇性離子監(jiān)測(cè)見(jiàn)表2。

表2　多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下的保留時(shí)間、定性、定量離子、去簇電壓及碰撞能量TTaabbllee 22 　　RReetteennttiioonn ttiimmee， qquuaalliittaattiivvee aanndd qquuaannttiittaattiivvee iioonnss， ddeecclluusstteerriinngg ppootteennttiiaall， aanndd ccoolllliissiioonn eenneerrggyy iinn mmuullttiippllee rreeaaccttiioonn mmoonniittoorriinngg （MMRRMM） mmooddee

2　　結(jié)果與分析

2.1樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

提取劑的選擇：比較了2 種提取劑乙腈和乙腈中加入乙酸混合提取劑的回收率，結(jié)果表明：乙腈提取劑的提取率偏低，致使回收率低于70%，而使用乙腈中加入乙酸混合提取劑的回收率能達(dá)到農(nóng)藥殘留檢測(cè)的要求，并最終確定采用乙腈中加入0.25%的乙酸提取。

2.2質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用0.05 mg/L的聯(lián)苯肼酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，以10 μL/min的流速進(jìn)行Q1掃描，確定母離子，在電噴霧正負(fù)離子模式下分別進(jìn)行全掃描。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在電噴霧正離子模式下，響應(yīng)較好，故選擇在電噴霧正離子掃描模式下進(jìn)行檢測(cè)，可滿(mǎn)足靈敏度要求。用蠕動(dòng)泵儀10 μL/min的流速連續(xù)注射，對(duì)聯(lián)苯肼酯進(jìn)行一極質(zhì)譜分析（Q1掃描），得到準(zhǔn)確分子離子峰；對(duì)準(zhǔn)確分子離子峰進(jìn)行二極質(zhì)譜分析（子離子掃描）得到碎片離子信息，優(yōu)化碰撞能量（圖1）。

圖 1　多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下聯(lián)苯肼酯標(biāo)準(zhǔn)品（a）、木瓜空白樣品（bb）、聯(lián)苯肼酯加標(biāo)樣品（2.0 ng/kg）（c）、聯(lián)苯肼酯烯加標(biāo)樣品（dd）總離子及定量離子流（ee）圖Fig.1　Total and quantitative ion current chromatograms of b ifenazate standard （a）， blank papaya sample （b）， sample spiked with bifenazate （c），and sample spiked with bifenazate-diazene （d）， under multiple reaction monitoring mode （e）

2.3方法的線性方程、精密度和回收率

2.3.1線性方程

將一定質(zhì)量濃度的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液按1.2.3節(jié)所述條件測(cè)定，以聯(lián)苯肼酯的定量離子峰面積（y）為縱坐標(biāo)，以其質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性方程及相關(guān)系數(shù)（表3）。結(jié)果表明：在0.25～2.0 ng/mL范圍內(nèi)，方程的線性關(guān)系良好。在此條件下，聯(lián)苯肼酯的保留時(shí)間為2.35 min。

表3　聯(lián)苯肼酯的線性方程及其相關(guān)系數(shù)TTaabbllee 33 　　LLiinneeaarr eeqquuaattiioonn wwiitthh ccoorrrreellaattiioonn ccooeeffffi i cciieenntt ffoorr bbiiffeennaazzaattee

2.3.2檢出限和定量限

根據(jù)3 倍信噪比計(jì)算，木瓜中聯(lián)苯肼酯的檢出限為5.89×10－6mg/kg，通過(guò)實(shí)際添加回收實(shí)驗(yàn)確定木瓜中聯(lián)苯肼酯的定量限為1.0×10－6mg/kg。

2.3.3精密度和回收率

在1.0、2.0 ng/kg和10.0 ng/kg 3 個(gè)添加量下進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，平均回收率在78.3%～109.8%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）在4.0%～8.8%之間，均滿(mǎn)足定量分析要求，結(jié)果見(jiàn)表4。

表 4　聯(lián)苯肼酯及聯(lián)苯肼酯烯添加平均回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n==55）Taabbllee 44 　　AAvveerraaggee rreeccoovveerriieess aanndd rreellaattiivvee ssttaannddaarrdd ddeevviiaattiioonnss （RRSSDD） ffoorr bifenazate and bifenazate-diazenee （n = 55）%

3　　結(jié) 論

本研究采用超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，以電噴霧正離子掃描和多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，建立了木瓜中聯(lián)苯肼酯及聯(lián)苯肼酯烯的殘留檢測(cè)方法。對(duì)其前處理?xiàng)l件進(jìn)行了考察，并優(yōu)化了質(zhì)譜條件，采用基質(zhì)匹配保準(zhǔn)曲線外標(biāo)法定量，保證了定量的準(zhǔn)確性。該方法對(duì)供試農(nóng)藥的定量限為1.0×10－6mg/kg，出峰時(shí)間為2.35 min，整個(gè)檢測(cè)時(shí)間為5 min，與傳統(tǒng)液相色譜相比，節(jié)省了檢測(cè)時(shí)間，提高了檢出限。串聯(lián)質(zhì)譜的檢測(cè)方法能夠避免雜質(zhì)的干擾，能很好地排除基質(zhì)干擾，提高分析的選擇性和檢測(cè)靈敏度，該方法的線性、靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度均能滿(mǎn)足殘留分析的要求。

［1］美國(guó)科聚亞公司. 聯(lián)苯肼酯［J］. 農(nóng)藥科學(xué)與管理， 2009， 30（8）: 61.

［2］王元元， 高寧， 李輝輝， 等. 殺螨劑聯(lián)苯肼酯的合成研究［J］. 精細(xì)化工中間體， 2011（6）: 13-15.

［3］DEKEYSER M A. Acaricide mode of action［J］. Pest Management Science， 2005， 61（2）: 103-110.

［4］van LEEUWEN T， TIRRY L， NAUEN R. Complete maternal inheritance of bifenazate resistance in Tetranychus urticae Koch （Acari: Tetranychidae） and its implications in mode of action considerations［J］. Insect Biochemistry and Molecular Biology， 2006，36（11）: 869-877.

［5］van LEEUWEN T， VONTAS J， TSAGKARAKOU A， et al. Acaricide resistance mechanisms in the two-spotted spider mite Tetranychus urticae and other important Acari: a review［J］. Insect Biochemistry and Molecular Biology， 2010， 40（8）: 563-572.

［6］OCHIAI N， MIZUNO M， MIMORI N， et al. Toxicity of bifenazate and its principal active metabolite， diazene， to Tetranychus urticae and Panonychus citri and their relative toxicity to the predaceous mites，Phytoseiulus persimilis and Neoseiulus californicus［J］. Experimental and Applied Acarology， 2007， 43（3）: 181 -197.

［7］TIRELLO P， POZZEBON A， CASSANELLI S， et al. Resistance to acaricides in Italian strains of Tetranychus urticae: toxicological and enzymatic assays［J］. Experimental and Applied Acarology， 2012，57（1）: 53-64.

［8］van NIEUWENHUYSE P， DEMAEGHT P， DERMAUW W， et al. On the mode of action of bifenazate: new evidence for a mitochondrial target site［J］. Pesticide Biochemistry and Physiology， 2012， 104（2）: 88-95.

［9］HIRAGAKI S， KOBAYASHI T， OCHIAI N， et al. A novel action of highly specifi c acaricide； bifenazate as a synergist for a GABA-gated chloride channel of Tetranychus urticae ［Acari: Tetranychidae］［J］. Neurotoxicology， 2012， 33（3）: 307-313.

［10］ 莊無(wú)忌. 國(guó)際食品飼料中農(nóng)藥殘留限量法規(guī): 第4卷［M］. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社， 2010: 292-293； 364； 496-497.

［11］ 莊 無(wú)忌. 國(guó)際食品飼料中 農(nóng)藥殘留限量法規(guī): 第3卷［M］. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社， 2010: 191-192.

［12］ 莊無(wú)忌. 國(guó)際食品飼料中農(nóng)藥殘留限量法規(guī): 第2卷［M］. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社， 2010: 102-103.

［13］ BANASIAK U， CALDAS E D， UNK S， et. al. JMPR. bifenazate 2006 report［R/OL］. ［2015-03-23］. http://www.fao.org/agriculture/crops/ core-themes/theme/pests/pm/lpe/it/.

［14］ 鄭軍紅， 龐國(guó)芳， 范春林， 等. 液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜 法測(cè)定牛奶中128 種農(nóng)藥殘留［J］. 色譜， 2009， 27（3）: 254-263.

［ 15］ ZHANG K， WONG J W， HAYWARD D G， et al. Multiresidue pesticide analysis of wines by dispersive solid-phase extraction and ultrahigh-performance liqu id chromatography-tandem mass spectrometry［J］. Journal of Agr icultural and Food Chemistry， 2009，57（10）: 4019-4029.

［16］ HENGE M J， MILLER M. Analysis of pesticides in dried hops by liquid chromatography-tandem mass spectrometry［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2008， 56（ 16）: 6851-6856.

［17］ 李巖， 鄭鋒， 王明林， 等. 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速篩查測(cè)定濃縮果蔬汁中的156 種農(nóng)藥殘留［J］. 色譜， 2009， 27（2）: 127-137.

［18］ 何建紅， 胡選祥， 趙帥鋒， 等. 聯(lián)苯肼酯在草莓上的殘留降解及其安全使用［J］. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2014， 6（5）: 1268-1272.

［19］ 戴魏， 李曉剛， 陳力華， 等. 聯(lián)苯肼酯在柑橘及其土壤中的殘留分析方法［J］. 農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)， 2012， 14（6）: 677-680.

［20］ 韓鳳， 楊仁斌， 傅強(qiáng)， 等. 聯(lián)苯肼酯在柑橘和土壤中的殘留分析方法［J］.農(nóng)藥， 2013， 52（2）: 122-124.

［21］ 曹巍， 陳高部， 關(guān)云飛， 等. 聯(lián)苯肼酯的高效液相色譜分析［J］. 農(nóng)藥，2011， 50（6）: 424-425.

［22］ 肖崢. 聯(lián)苯肼酯43%懸浮劑的高效液相色譜分析［J］. 農(nóng)藥科學(xué)與管理， 2010， 31（8）: 40-42.

［23］ 張燕， 葉進(jìn)剛， 王麗珍， 等. 40%聯(lián)苯肼酯·螺螨酯懸浮劑的高效液相色譜分析［J］. 中國(guó)農(nóng)藥， 2014， 14（1）: 57-60.

［24］ 劉光學(xué)， 喬雄梧， 陶傳江， 等. NY/T 788—2004 農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則［S］.北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社， 2004.

［25］ 劉瀟威， 買(mǎi)光熙， 李凌云， 等. NY/T 761—2008 蔬菜和水果中有機(jī)磷、有機(jī)氯、擬除蟲(chóng)菊酯和氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥多殘留的測(cè)定［S］.北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社， 2008.

Determining of Bifenazate and Its Metabolite Residues in Papaya by Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

ZHANG Yue， HAN Bingjun， ZHAO Fangfang
（Hainan Provinc ial Key Laboratory of Quality and Safety for Tropical Fruits and Vegetables， Analysis and Testing Center，Chinese Academy of Tropical Agriculture Science， Haikou571101， China）

An ultra performance liquid chromatography-tan dem mass spectrometry （UPLC-MS/MS） method for the determination of residues of bifenazate and its metabolite bifenazate-diazene in papaya was established. The sample was extracted with acetonitrile and acetic a cid （0.25%） after being homogenized. The organic phase was then separated fro m water phase b y adding sodium chloride and derivatized for 60 min after the addition of 0.25%. Finally， the target analytes were separated by a Waters ACQUITY UPLC BEH C18column （50 mm × 2.1 mm， 1.7 μm）. A tandem quadrupole mass spectrometer operated in MS/MS mode for multiple-reaction monitoring （MRM） was used for the qualitative and quantitative analyses of the const itue nts. The results showed that the av erage recoveries of bifenazate and bifenazate-diazene ranged from 78.3% to 109.8% with relative standard deviation （ RSDs） of 4.0%-8.8% at spiked levels from 1.0 to 10.0 ng/kg （n = 5）. The calibration curves showed good li nearity in the range of 0.25-2.0 ng/mL， with correlation coeffi cient over 0.999 8. The limit of quantifi cation （LOQ） was 1×10-6mg/kg for both bifenazate and its metabolite. The method is applicable for the determination of bifenazate pesticide residues in papaya.

ultra per formance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS）； papaya； bifenazate；bifenazate-diazene； residue

O657.72；S482.3

A

1002-6630（2015）24-0270-04

10.7506/spkx1002-6630-201524050

2015-02-04

張?jiān)拢?981—），女，助理研究員，碩士，主要從事農(nóng)藥殘留登記研究。E-mail：ghzy_0708@163.com