HPLC-DAD結合交替三線性分解二階校正法測定荔枝果肉中游離植物甾醇

項雷文，陳國泰，翁佳敏，陳文韜，汪少蕓*

（1.福建師范大學福清分校海洋與生化工程學院，福建 福清　　350300；2.福州大學生物科學與工程學院，福建 福州　　350108）

HPLC-DAD結合交替三線性分解二階校正法測定荔枝果肉中游離植物甾醇

項雷文1，陳國泰1，翁佳敏1，陳文韜1，汪少蕓2，*

（1.福建師范大學福清分校海洋與生化工程學院，福建 福清350300；
2.福州大學生物科學與工程學院，福建 福州350108）

為快速測定荔枝果肉中游離植物甾醇含量，建立高效液相色譜-二極管陣列檢測器結 合基于交替三線 性分解算法的二階校正方法。基本色譜條件：島津ODS-SP柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），流動相體積分數95%乙腈溶液，檢測波長范圍為190～340 nm，柱溫30 ℃，流速1.0 mL/min，進樣量20.0 μL。結果表明，‘蘭竹’和‘烏葉’荔枝樣品中菜油甾醇含量分別為24.1 μg/g和27.4 μg/g，兩種荔枝樣品豆甾醇含量分別為25.8 μg/g和26.7 μg/g，菜油甾醇和豆甾醇加標回收率分別為（95.25±0.78）%和（96.83±1.01）%。所建立的方法簡單、準確、靈敏度高且可靠，可用于檢測荔枝果肉中游離植物甾醇含量。

高效液相色譜；二極管陣列檢測器；交替三線性分解；二階校正；植物甾醇

植物甾醇是果蔬中的生物活性物質，進入人體后可降低體內膽固醇含量［1］。文獻報道有多種檢測植物甾醇的方法，如洋地黃皂苷沉淀法［2］，植物甾醇經酶催化氧化后的比色法［3］、薄層色譜法［4］、分光光度法［5］、紅外光譜法［6］等，還有使用不同檢測器的氣相色譜法［7-8］和高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法［9-13］。但是沉淀法和比色法只能定量總植物甾醇，氣相色譜法在檢測植物甾醇前需要衍生化處理，質譜定量中植物甾醇信號較弱。因此植物甾醇定量分析首選HPLC法。

按常規HPLC法，配合相應的提取技術及前處理方法［14-17］，雖能得到比較滿意的結果。但植物甾醇常作為細胞膜的重要結構成分和脂質存在于植物細胞，有的以游離態存在，有的與糖類、脂肪酸等結合以結合態存在，如甾醇酯、甾苷和乙酰基甾苷等［18］，已發現的植物甾醇超過250 種［19］。最具代表性的和含量較高的植物甾醇有菜油甾醇、膽甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇，而麥角甾醇則常存在于發霉的植物中［19］。植物甾醇是分子結構帶有四環環戊二烯［α］的菲環和在第17個碳原子上有一條柔性長鏈的類固醇化合物及其衍生物［20］，不同植物甾醇結構相似（圖1），因而常規色譜分析中要達到基線分離需要足夠長的洗脫時間；并且果蔬為復雜體系，檢測前需要對樣品進行預處理，盡量去除干擾，以求響應信號的簡單化。因此，需要對常規LC方法進行改進。

圖 1　游離甾醇化學結構示意圖Fig.1　Chemical structures of free phytosterols

交替三線性分解（a l t e r n a t i n g t r i-l i n e a r decomposition，ATLD）算法利用基于切尾奇異值分解的Moore-Penrose廣義逆計算和交替迭代來進行三線性數據分解，使損失函數即殘差陣元素的平方和達到極小值，詳見參考文獻［21］。二階校正方法以“數學分離”來部分代替或強化“理化分離”，在有未知干擾物和背景條件下實現復雜體系中目標分析組分的快速有效分離定量，定量條件不要求達到基線分離，洗脫時間縮短。

本實驗以荔枝果肉為檢測對象，利用HPLC-二極管陣列檢測器（HPLC-diode array detector，HPLC-DAD）結合基于ATLD算法的二階校正方法，使預處理簡單快速，并允許部分色譜峰重疊，簡化測量步驟并節省檢測時間，從而建立起一種快速、穩定的植物甾醇分析方法。結果顯示，其預處理簡單，單次樣本測試所耗時間較短，可作為快速定量植物甾醇的可選擇方法。

1　　材料與方法

1.1材料與試劑

荔枝市購，經本校植物學教師鑒定為‘蘭竹’、‘烏葉’2 個品種。

菜油甾醇、膽固醇、豆甾醇、β-谷甾醇、麥角甾醇西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司；甲醇、乙腈（均為色譜純）百靈威科技有限公司；硫酸、乙醇、正己烷、特丁基對苯二酚、氫氧化鈉（均為分析純）國藥集團化學試劑有限公司；實驗用水為實驗室自制去離子水。

1.2儀器與設備

FW100高能粉碎機天津泰斯特儀器有限公司；101-A型數顯式電熱恒溫干燥箱上海陽光實驗儀器有限公司；英展ALH-3天平上海英展機電企業有限公司；BLST-500Q球形脂肪抽出器上海比朗儀器有限公司；UGC-12C旋轉式水浴氮吹儀北京優晟聯合科技有限公司；RE52A型旋轉蒸發器鞏義市予華儀器有限責任公司；HH-4型數顯恒溫水浴鍋國華電器有限公司；超聲波清洗機廣州邦潔超聲波設備有限公司；1100 HPLC儀（配有G1311A四元泵、G1313A自動進樣器、G1322A在線脫氣機、G1316柱溫箱、G1315A二極管陣列檢測器）安捷倫科技有限公司。

1.3方法

1.3.1標準品配制

菜油甾醇（0.5 mg/mL）、膽固醇（1.0 mg/mL）、豆甾醇（0.5 mg/mL）、β-谷甾醇（1.0 mg/mL）和麥角甾醇（1.0 mg/mL）溶于甲醇中配成標準物質儲備液，置于冰箱－20 ℃保存。在使用之前取出放至室溫，而后稀釋成系列質量濃度的溶液。

1.3.2荔枝果肉樣品中植物甾醇提取

荔枝果肉樣品中植物甾醇提取及預處理程序參考文獻［22］。荔枝去殼去核后，稱質量，將果肉洗凈用濾紙擦干，將其切成片狀。在105 ℃條件下烘至恒質量，將荔枝果肉放入粉碎機內攪碎成顆粒狀，得到荔枝果肉干品，放入干燥器中保存。用天平準確稱量10.00 g荔枝果肉粉，折好濾紙套后放入，再安裝索氏提取器，加入提取溶劑正己烷至圓底燒瓶，將荔枝果肉粉中的粗脂肪提取出來。用旋轉蒸發器減壓揮盡得到的粗脂肪中的溶劑后，于圓底燒瓶中加入10 mL鹽酸的乙醇溶液，安裝回流裝置于80 ℃水浴中加熱1 h，每隔10 min振蕩圓底燒瓶一次至回流結束，結束后冷卻至室溫，再加入氫氧化鉀的乙醇溶液20 mL，再安裝回流裝置于70 ℃水浴中加熱1 h，每隔10 min振蕩圓底燒瓶一次至回流結束，結束后冷卻至室溫。

冷卻至室溫后加入100 mL水和正己烷，攪拌均勻后轉移至分液漏斗中萃取3～4 次，合并萃取液，將多次實驗（共100.00 g荔枝果肉粉）所得的萃取液集中，用旋轉蒸發儀蒸除正己烷后濃縮得甾醇粗品，用甲醇溶解定容至10 mL，得到檢測樣品。

1.3.3校正樣品配制

該方法的組內精密度（可重復性）通過測定單點質量濃度（160 μg/mL）來獲得，檢測6 次取其平均值，并獲得相對標準偏差，即可確認色譜條件的系統精密度。所配校正樣的質量濃度范圍見表1。

表1　校正樣質量濃度Taabbllee 11 　　PPhhyyttoosstteerrooll ccoonntteennttss ooff ccaalliibbrraattiioonn ssaammpplleessμg/mL

1.3.4加標實際樣品配制

樣品加入標準品后，其后樣品提取及預處理程序同1.3.2節。方法的準確度通過計算樣品的加標回收率來確定。

1.3.5色譜條件

色譜柱：島津ODS-SP柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水（95∶5，V/V）溶液；檢測波長190～340 nm；進樣量20 μL；柱溫30 ℃；流速1.0 mL/min。

2　　結果與分析

2.1色譜分離條件的優化

圖2　 混合植物甾醇標準物質HPLC色譜圖Fig.2　　HPLC profi les of mixed phytosterol standard materials

植物甾醇是極性非常弱的小分子化合物，在反相色譜柱上有很強的保留性。因此植物甾醇需要高濃度的有機溶劑來降低其在色譜柱上的保留性來實現分離。為了得到較好的分離效果，選擇波長210 nm作為檢測波長，對分析柱和流動相進行了優化，5 種植物甾醇標準品的HPLC色譜結果如圖2所示。在所采用的HPLC色譜條件下，麥角甾醇、膽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇的保留時間分別為10.30、13.10、14.79、15.16、17.13 min，分析時間適中。由于不同植物甾醇分子結構極其相似，菜油甾醇和豆甾醇色譜峰出現重疊，未能實現基線分離。如用常規LC法來定量，會因為譜峰重疊及未知干擾的影響使得各組分的保留時間及含量出現偏差。因此需要對色譜峰進行分段解析。

分段解析主要針對菜油甾醇和豆甾醇重疊部分進行，利用基于三線性分解的二階校正方法所得到的純光譜數據及純色譜數據分別繪圖，再與標 準品在相同條件下測得的光譜和色譜圖形進行對比，并以相應譜圖的重合程度作為定性依據，得到更直觀的定性結果。再根據標樣質量濃度進行定量分析，得到預測樣含量，并以加標回收率及算法品質因子來驗證和評價本實驗所采用的方法。

實際樣、加標實際樣及校正樣的保留時間在14.4～15.8 min之間的色譜對照圖如圖3所示。

圖 3　　實際樣、加標實際樣及校正樣的色譜對照圖Fig.3　　Comparative chromatographic profi les of spiked real sample，real sample and calibration sample

2.2定性分析

圖 4　　解析出的譜圖與真實譜圖對比Fig.4　　Comparison between resolved profi les and actual profi les

前段數據包含2 個目標分析組分，各貢獻一個因子，其余信號包括背景、噪聲干擾等提供一個因子，即選取的解析組分數為3；后段數據包含一個目標分析組分，其余信號提供一個因子，即選取的解析組分數為2。ATLD算法在相應組分數條件下，解析HPLC-DAD得到的矩陣數據所構成的三維數陣，解析出的圖譜與由校正樣解析出的標準品圖譜的對照圖如圖4所示。算法解析出的色譜、光譜圖的輪廓與對照品的色譜、光譜圖分別重合較好，說明從色譜、光譜2 個角度上都證明了實際樣中菜油甾醇和豆甾醇的存在。

2.3定量分析

由ATLD算法分解所得到的相對濃度矩陣對照標樣含量進行后續回歸處理就能夠實現定量預測。本方法得出的實際樣中菜油甾醇和豆甾醇的預測含量如表2所示。

表2　ATLD算法分辨獲得的實際樣品中菜油甾醇和豆甾醇的含量TTaabbllee 22 　　RReessoollvveedd ccoonntteennttss ooff ccaammppeesstteerrooll aanndd ssttiiggmmaasstteerrooll iinn real samples using ATLLDD

對算法的評價用到的品質因子計算和純分析物信號密切相關，包括：靈敏度、選擇性、檢測限及與預測精密度相關的預測均方差等［21］。計算的各品質因子見表3。加標回收率的計算結果見表4。

表 3 ATLD算法品質因子Taabbllee 33 　　FFiigguurreess ooff mmeerriitt ooff tthhee pprrooppoosseedd mmeetthhoodd uussiinngg AATTLLDD

表 4　加標回收率實驗結果TTaabbllee 44 　　RReeccoovveerriieess ooff pphhyyttoosstteerroollss ffrroomm ssppiikkeedd lliittcchhii ppuullpp

由表4可知，菜油甾醇和豆甾醇的加標回收率平均值分別為：（95.25±0.78）%和（96.83±1.01）%，加標回收率小于100%。提取植物甾醇過程中，受熱會使植物甾醇分子雙鍵斷裂，而導致損失。通過查表可得到t-檢驗的t值，t（6，0.10）=1.940。由t-檢驗公式計算得到的t值分別為0.784、0.946，它們均小于t（6，0.10）值。以上結果表明二階校正方法得到的結果是可靠的。

2.4分析方法的應用

表5　荔枝果肉樣品中植物甾醇含量TTaabbllee 55 　　TThhee ccoonntteennttss ooff pphhyyttoosstteerrooll iinn lliittcchhii ppuullppμg/g

為驗證所建立的植物甾醇定量分析方法，從荔枝樣品中提取、分離并檢測植物甾醇。樣品處理如上所述，每個樣品5 次平行。分析在最優條件下進行。所測得的膽固醇、麥角甾醇、豆甾醇、菜油甾醇和β-谷甾醇的含量列于表5。總植物甾醇含量隨荔枝品種不同有所區別，含量在102.4～113.2 μg/g之間。各種植 物甾醇中，‘蘭竹’和‘烏葉’荔枝果肉中膽甾醇含 量最高，分別為37.2 μg/g和43.1 μg/ g。β-谷甾醇含量最少，分別為15.3 μg/g和16.0 μg/g。菜油甾醇和豆甾醇含量差不多，分別為24.1 μg/g和27.4 μg/g，25.8 μg/g和26.7 μg/g。該檢測結果和氣相色譜分析荔枝中植物甾醇含量結果［23］相近。

3　　結 論

本實驗所建立的用HPLC-DAD結合基于ATLD算法的二階校正方法，能夠快速、可靠地對荔枝果肉中麥角甾醇、膽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇定量分析。與傳統的LC法相比，該方法的優勢在于使預處理簡單化，色譜條件相對簡單并允許部分色譜峰重疊及存在未知干 擾，測試所耗時間較短，試劑消耗量相對較少。

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Determination of Free Phytosterols in Litchi Pulp by HPLC-DAD Coupled with Second-Order Calibration Based on Alternating Trilinear Decomposition

XIANG Leiwen1， CHEN Guotai1， WENG Jiamin1， CHEN Wentao1， WANG Shaoyun2，*
（1. School of Ocean Science and Biochemistry Engineering， Fuqing Branch of Fujian Normal University， Fuqing350300， China；2. College of Biological Science and Engineering， Fuzhou University， Fuzhou350108， China）

A rapid method to quantify free phytosterols in litchi pulp was established with high performance liquid chromatography with diode array detection （HPLC-DAD） coupled with second-order calibration method based on alternating trilinear decomposition （ATLD） algorithm. The chromatographic conditions were simplifi ed by applying secondorder calibration method. The mobile phase was 95% aqueous acetonitrile （V/V） at a fl ow rate of 1.0 mL/min. The injection volume was 20.0 μL. The temperature of inertsil ODS-SP （150 mm × 4.6 mm， 5 μm） column was set at 30 ℃. The detection wavelengths were 190-340 nm. The average spiked recoveries of campesterol and stigmasterol in litchi pulp were （95.25 ± 0.78）% and （96.83 ± 1.01）%， respectively. The pulp of “Lanzhu” and “Wuye” litchi was detected to contain 24.1 and 27.4 μg/g campesterol， and 25.8 and 26.7 μg/g stigmasterol， respectively. The newly established method is simple， accurate， highly sensitive and reliable， and can be used to determine free phytosterols in litchi pulp.

high performance liquid chromatography （HPLC）； diode array detector （DAD）； alternating trilinear decomposition （ATLD）； second-order calibration； phytosterols

TS207.3

A

1002-6630（2015）24-0172-05

10.7506/spkx1002-6630-201524031

2015-06-12

福建省省級重點學科“食品科學與工程”建設項目（閩教高［2012］48號）；福建省區域科技重大項目（ 2014N3005）

項雷文（1975—），男，副教授，博士，主要從事天然產物綜合利用，生物大分子分離與表征，食品中美拉德反應研究。E-mail：xiangleiwen@163.com

汪少蕓（1972—），女，教授，博士，主要從事食品化學、生物活性蛋白質、酶和多肽及食品生物技術研究。E-mail：shywang@fzu.edu.cn