響應面試驗優化超臨界CO2萃取胭脂蘿卜籽油工藝及其脂肪酸組成分析

張 杰，鄧 旭，邵承斌，*，余 洋，梁 崇（1.催化與功能有機分子重慶市重點實驗室，重慶　400067；.重慶工商大學環境與資源學院，重慶　400067）

響應面試驗優化超臨界CO2萃取胭脂蘿卜籽油工藝及其脂肪酸組成分析

張 杰1，2，鄧 旭2，邵承斌1，2，*，余 洋2，梁 崇2
（1.催化與功能有機分子重慶市重點實驗室，重慶400067；2.重慶工商大學環境與資源學院，重慶400067）

以胭脂蘿卜籽為原材料，采用響應面試驗優化超臨界CO2萃取胭脂蘿卜籽油工藝，并對胭脂蘿卜籽油脂肪酸組成進行分析。首先Plackett-Burman設計對影響超臨界萃取的7 個因素進行篩選，獲得影響提取率的3個主要因素：萃取壓力、萃取溫度、萃取時間；然后用最陡爬坡路徑逼近最大響應區域；最后通過Box-Behnken設計進行三因素三水平試驗及響應面分析，確定最佳萃取工藝條件 為萃取壓力34 MPa、萃取溫度44 ℃、萃取時間91 min，提取率預測值為93.11%，驗證值為（93.09±0.80）%。采用氣相色譜-質譜聯用分析脂肪酸組成，結果表明胭脂蘿卜籽油各脂肪酸組成與菜籽油相似，不飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸含量分別為89.01%和67.50%。

響應面；蘿卜籽油；胭脂蘿卜；超臨界CO2萃取

蘿卜（Raphanus sativus L.），又名萊菔、土人參，是一種普遍種植于我國低海拔地區的十字花科蔬菜作物。中國栽培蘿卜已有2 700多年的歷史，經過長期的選擇，形成了眾多的蘿卜品種，常見的有紅蘿卜、青蘿卜、白蘿卜、水蘿卜和心里美等。胭脂蘿卜主要產于重慶的武隆、涪陵、南川等地，這些地區氣候溫和、空氣濕潤，已有100余年的種植歷史［1-2］。胭脂蘿卜從表皮到內部通紅，花青素含量高，肉質酥脆，適宜加工各種蘿卜制品，用作泡菜久泡不爛，鮮紅嫩脆。

蘿卜籽，又名萊菔子、菜頭子等，是蘿卜的成熟種子。蘿卜籽可下氣定喘，消食化痰。蘿卜籽成分具有健腦益智作用，還可防治各類疾病，如抗心血管疾病、抗癌、抗炎癥和抗衰老作用［3-4］。蘿卜籽的化學成分很多，但大部分為脂肪酸，尤其以不飽和脂肪酸為主［5-8］。蘿卜籽油中富含維生素A、B、D、E和多種微量元素，有“東方橄欖油”之稱。蘿卜籽油具有潤腸通便、清熱解毒、調節血壓和降血脂等功能，既可美容養顏，又能抗輻射、抗衰老。

蘿卜籽油提取的報道以常規溶劑提取方法為主，存在提取率低、速率慢、污染大等不利因素，限制了蘿卜籽油的開發應用［9］。近年來超臨界CO2萃取技術己經被用于油脂的萃取，它是利用CO2在超臨界狀態下對溶質有很高的溶解能力，而在非超臨界狀態下對溶質的溶解能力又很低的這一特性，來實現對目標成分的提取和分離［10-15］。該法逐漸應用于具有高附加值的保健品用油提取，如李莉等［16］研究了超臨界CO2萃取油茶好油的工藝，任燕冬等［17］研究了超臨界CO2萃取杏仁油的工藝，此外還有對葡萄籽油、茶葉籽油、獼猴桃籽油、沙棘油、小麥胚芽油、紅花籽油等的研究［18-22］。超臨界CO2萃取具有傳質速率快、提取率高、操作條件溫和、無有機溶劑殘留等特點。

本研究從提取工藝的萃取效率、產品純度、溶劑殘留等角度進行綜合考慮，將重慶地區特有的胭脂蘿卜種子（胭脂蘿卜籽）作為原料，釆用超臨界CO2萃取技術萃取胭脂蘿卜籽油，以提取率為指標，應用響應面法優化萃取工藝，確定最佳工藝參數，并采用氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）聯用測定胭脂蘿卜籽油的脂肪酸組成，為進一步開發胭脂蘿卜籽油這一新植物油源提供理論依據。

1　材料與方法

胭脂蘿卜籽重慶海巨農業發展有限公司；CO2氣體（純度＞99.5%，食品級）重慶晉升氣體有限公司。

1.2儀器與設備

HA221-50-06超臨界CO2萃取設備江蘇南通市華安超臨界萃取有限公司；JY2002電子分析天平上海精密科學儀器有限公司；101-1AB電熱鼓風干燥箱天津市泰斯特儀器有限公司；XY-100高速多功能粉碎機浙江省永康松青五金廠；GC6890/5973N型GC-MS聯用儀美國Agilent公司。

1.3方法

1.3.1胭脂蘿卜籽油萃取

5月4日，全國水利財務工作會議在北京召開。水利部部長陳雷出席會議并作重要講話（本期“特別關注”全文刊發）。中紀委駐部紀檢組組長董力出席并講話。水利部副部長周英主持會議并作會議總結。

胭脂蘿卜籽經篩選、干燥、粉碎過篩，定量稱取30～50 目的胭脂蘿卜籽粉末，裝入超臨界萃取裝置的物料筒，置于萃取釜中，打開冷循環制冷及氣閥，設置萃取釜、分離Ⅰ和分離Ⅱ的溫度。當制冷設備停止工作時，打開高壓泵，并打開相應閥門保持通路狀態。通過控制流量計來調節CO2的流量，循環維持一定時間，萃取完畢后打開分離釜排料閥，收集油脂。稱取其質量，計算提取率。

1.3.2Plackett-Burman試驗設計

在文獻資料及預實驗的基礎上選用N=12的Plackett-Burman試驗設計，對萃取壓力、萃取溫度、萃取時間、CO2流量、投料量、分離Ⅰ壓力、分離Ⅰ溫度7 個因素進行考察，每個因素取高（+1）、低（－1）兩個水平，響應值為提取率Y，試驗因素和水平見表1。

表1　Plackett-Burman試驗因素與水平Table 1 Factors and levels used in Plackett-Burman design

1.3.3最陡爬坡試驗

響應面擬合方程只有在考察的緊接鄰域里才能充分近似真實情形，要先逼近最佳值區域后才能建立有效的響應面擬合方程。最陡爬坡法以試驗值變化的梯度方向為爬坡方向，根據各因素效應值的大小確定變化步長，能快速、經濟地逼近最佳值區域［23］。根據Plackett-Burman試驗結果中各顯著影響因素效應的大小設定步長及變化方向，以快速逼近最佳區域。而其他因素的取值則根據各因素效應的正負和大小確定，正效應的因素均取較高值，負效應的因素均取較低值。

1.3.4Box-Behnken試驗設計

依據Plackett-Burman試驗和最陡爬坡試驗確定的試驗因素與水平，采用Box-Behnken試驗設計進行三因素三水平的響應面分析試驗。以提取率作為響應值，試驗因素與水平見表2。

表2　Box-Behnken試驗因素與水平Table 2 Factors and levels used in Box-Behnken design

1.3.5脂肪酸組成分析

采用GC-MS分析胭脂蘿卜籽油的脂肪酸組成［24］。

1.3.5.1胭脂蘿卜籽油的甲酯化

稱取5.0 g胭脂蘿卜籽油，加入1 mol/L的KOH-甲醇溶液30 mL，對胭脂蘿卜籽油進行皂化處理，收集皂化物。取5.0 g皂化物，加入30 mL 2%硫酸-甲醇溶液進行甲酯化，得到甲酯化的蘿卜籽油并進行GC-MS分析。

1.3.5.2GC-MS條件

色譜柱：DB-5MS毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；初始溫度100 ℃，保持1 min，以8 ℃/min升至290 ℃，保持15 min，進樣口溫度280 ℃；載氣為氦氣，流速0.8 mL/min，進樣1 μL，分流比50∶1。離子源，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，接口界面溫度280 ℃，四極桿溫度150 ℃，發射電流34.6 μA，質量掃描范圍m/z 20～550 u。

2　結果與分析

2.1Plackett-Burman篩選影響提取率的顯著因子

Plackett-Burman是一種兩水平的試驗設計方法，基于非完全平衡塊原理，可以用最少試驗次數估計出因素的主效應，適用于從眾多的考察因素中快速有效地篩選出最為重要的幾個因素，為進一步研究提供依據［25］。Plackett-Burman試驗設計與結果見表3。

表3　Plackett-Burman試驗設計與結果Table 3 Plackett-Burman design with experimental results

表4　Plackett-Burman試驗設計效應分析Table 4 Statistical analysis of Plackett-Burman design

采用Design-Expert 8.0.5軟件進行數據統計分析，各因素效應分析結果見表4。由分析結果可知，超臨界CO2萃取胭脂蘿卜籽油的過程中，萃取壓力和萃取溫度對提取率影響極顯著，可信度在99%以上，萃取時間影響顯著，可信度在95%以上，另外4 個因素則低于90%。因此，將萃取壓力、萃取溫度、萃取時間作為主要因素進一步做響應面試驗研究。而其他因素的取值則根據各因素效應的正負和大小，正效應的因素均取較高值，負效應的因素均取較低值。

2.2最陡爬坡試驗結果

表5　最陡爬坡試驗設計與結果Table 5 Experimental design and results of steepest ascent path

最陡爬坡法以Plackett-Burman試驗結果為依據，爬坡路徑與主要因素的效應（正負）一致。試驗中，萃取壓力、萃取溫度和萃取時間3 個主要因素均呈顯著正效應，取值應增加，根據這3 個因素效應大小的比例設定它們的變化方向及步長。投料量和分離Ⅰ溫度呈負效應，在后續試驗中應選取Plackett-Burman試驗中的低水平200 g和30 ℃；CO2流量和分離Ⅰ壓力呈正效應，選取Plackett-Burman試驗中的高水平21 kg/h和9 MPa。最陡爬坡試驗設計與結果如表5所示。結果顯示，在第4次試驗附近提取率最高，因此以該試驗點為中心點進行響應面試驗設計。

2.3Box-Behnken試驗設計與響應面分析

2.3.1Box-Behnken試驗設計與結果

根據Box-Behnken試驗設計原理，以萃取壓力（X1）、萃取溫度（X2）、萃取時間（X3）為變量，胭脂蘿卜籽油的提取率（Y）為響應值，做三因素三水平的響應面分析試驗，試驗設計與結果見表6。

表6　Box-Behnken試驗設計與結果Table 6 Box-Behnken program with experimental results

2.3.2二次回歸模型擬合及方差分析

表7　模型的方差分析Table 7　Analysis of variance of the fi tted model

利用Design-Expext 8.0.5軟件對表6試驗數據進行回歸分析，得到二次多元回歸模型（實際）：Y=－376.539 6+10.583 9X1+9.845 2X2+1.543 9X3+ 0.008 7XX－0.001 3XX+0.001 3XX－0.158 9X2－

1213231

0.116 0X22－0.008 5X32，對回歸方程進行顯著性檢驗及方差分析，結果見表7。從表7可以看出，X1、X2、X3均達到極顯著程度，且影響超臨界CO2萃取胭脂蘿卜籽油的因素主次為萃取壓力＞萃取溫度＞萃取時間。從方差分析結果可知，方程的F值為999.863，模型P＜0.000 1，說明用上述回歸方程描述因素與響應值之間的關系時，其因變量與所有自變量之間的線性關系極顯著（R2=0.999 2），即此試驗方法是可靠的。失擬項F=3.321 7＜F0.05（9，3）= 8.81，P=0.138 2＞0.05，在P＜0.05水平上影響不顯著，模型的調整確定系數R2Adj=0.998 2，說明該模型擬合程度良好，試驗誤差小，可用此模型來分析和預測超臨界CO2萃取胭脂蘿卜籽油的工藝結果。模型的信噪比為84.990，遠大于4，說明獲得的模型完全可以用來對試驗結果進行擬合。

2.3.3各因素交互影響的響應面分析

由回歸方程擬合得到響應面圖，對任何兩因素交互影響提取效果進行分析。如圖1a所示，萃取時間為90 min時，萃取壓力和萃取溫度兩者的增加有助于提高提取率。超臨界狀態下，壓力和溫度稍有變化，超臨界流體密度就顯著地變化。萃取壓力的升高，不僅增加了超臨界CO2流體的密度，還減少了分子間的傳質阻力，增加溶質與溶劑之間的傳質效率；溫度的升高在一定范圍內降低了流體密度，但隨著壓力的提高，傳質系數卻大大提高，成為影響萃取的主導因素，兩者的交互作用，最終提高了提取率。如圖1b所示，萃取溫度為44 ℃時，隨著萃取時間及萃取壓力的延長和增大，提取率顯著增大，達到一定值之后，提取率則明顯降低。萃取溫度一定時，萃取壓力增加，使超臨界CO2流體的密度增加，流體的溶劑化效應加強，溶質的溶解度增加，提取率上升；當壓力增加到一定程度后，溶解增加緩慢，而且流體選擇性降低。如圖1c所示，萃取壓力為34 MPa時，隨著萃取時間及萃取溫度的延長及升高，提取率顯著增大，達到最大值之后，提取率則開始降低。隨著溫度的升高，CO2流體的黏度下降，傳質系數升高，有利于溶質擴散速度的提高，同時，溶質的蒸汽壓上升使溶解度升高，進而有利于提高萃取得率；此外，溫度升高使流體密度減小，導致流體溶解度下降，對萃取反而不利。

圖 1　各因素對提取率交互影響的響應面圖Fig.1　Response surface plots showing the effects of temperature， time and pressure on extraction rate

2.3.4萃取條件優化及驗證實驗結果

根據所建立的數學模型進行參數最優化分析，得到優化條件為萃取壓力34.35 MPa、萃取溫度44.20 ℃、萃取時間91.07 min，提取率預測值為93.11%。為進一步驗證響應面分析法所建立的數學模型的準確性，有必要對推斷方案進行驗證實驗。采用上述條件取整數即萃取壓力34 MPa、萃取溫度44 ℃、萃取時間91 min，進行6 次重復驗證實驗，測得提取率為（93.09±0.80）%，實驗值與理論預測值接近，證明了方程的可靠性與統計學方法的有效性，可將此方案作為超臨界CO2萃取胭脂蘿卜籽油的最優條件。

2.4脂肪酸組成分析

表 8　胭脂蘿卜籽油脂肪酸組成Table 8　Fatty acid composition of“Yaannzzhhii ” radish seed oiill %

采用GC-MS分析了胭脂蘿卜籽油的脂肪酸組成。表8比較了胭脂蘿卜籽油與菜籽油的脂肪酸組成，菜籽油脂肪酸組成摘錄于GB 1536—2004《菜籽油》［26］。從表8可以看出，胭脂蘿卜籽油各脂肪酸組成與菜籽油相似，含有豐富的芥酸、油酸、亞油酸、亞麻酸、花生一烯酸等不飽和脂肪酸，芥酸含量為36.50%，油酸含量為19.62%，亞油酸含量為11.36%，不飽和脂肪酸含量達89.01%，單不飽和脂肪酸含量達67.50%。與高文庚等［9］測定的結果相比，大部分脂肪酸含量差別較大，這可能與蘿卜籽品種及油脂提取方法有關。胭脂蘿卜籽油可作為一種富含不飽和脂肪酸的食用油脂，該實驗結果為胭脂蘿卜籽油的進一步開發利用提供理論依據。

33　結 論

本研究經響應面方法優化，得出超臨界CO2萃取胭脂蘿卜籽油的最佳工藝為：萃取壓力34 MPa、萃取溫度44 ℃、萃取時間91 min。在優化條件下進行6 次重復驗證實驗，測得提取率為（93.09±0.80）%，與提取率預測值為93.11%接近，證明了方程的可靠性與統計學方法的有效性。

實驗證明響應面方法對超臨界CO2萃取工藝優化是非常有效的工具，Plackett-Burman試驗設計能對影響提取率的各因素效應進行評價并能有效地找出主要因素，最陡爬坡法能充分接近最大響應面區域，Box-Behnken試驗設計能建立主要因素影響提取率的二次多項數學模型，并利用統計學方法對該模型進行了顯著性檢驗，優化了內在因素水平，找出最佳值。

經GC-MS分析，胭脂蘿卜籽油各脂肪酸組成與菜籽油相似，含有豐富的不飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸，具有較高的開發應用價值。

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Optimization of Supercritical CO2Extraction of “Yanzhi” Red Radish Seed Oil and Analysis of Its Fatty Acid Composition

ZHANG Jie1，2， DENG Xu2， SHAO Chengbin1，2，*， YU Yang2， LIANG Chong2
（1. Chongqing Key Laboratory of Catalysis and Functional Organic Molecule， Chongqing400067， China；2. College of Environment and Resources， Chongqing Technology and Business Univer sity， Chongqing400067， China）

Response surface methodology was used to optimize the extraction process of seed oil from “Yanzhi” red radish by supercritical CO2， and the fatty acid composition of the oil was determined. The Plackett-Burman design was used to evaluate the influence of seven factors on extraction efficiency， and three important extraction parameters， including extraction pressure， temperature and time， were selected. Steepest ascent path was adopted to approach the optimal response region of the three significant factors， and then response surface analysis based on Box-Behnken design was used to determine the optimal levels of the main factors. As a result， the optimal extraction conditions were established as follows: the extraction was conducted at 34 MPa and 44 ℃ for 91 min. Under these conditions， the predicted and experimental extraction rates of radish seed oil were 93.11% and （93.09 ± 0.80） %， respectively. The fatty acid composition of “Yanzhi” radish seed oil，as determined by gas chromatography tandem mass spectrometry （GC-MS）， was similar to that of rapeseed oil. The contents of unsaturated and monounsaturated fatty acids in the radish seed oil were 89.01% and 67.50%， respectively.

response surface methodology； radish seed oil； “Yanzhi” radish； supercritical CO2extraction

TS224.4；TS225.6

A

1002-6630（2015）24-0046-05

10.7506/spkx1002-6630-201524008

2015-05-17

重慶市教委科學技術研究項目（KJ1400616；KJ1500622）；重慶工商大學科研啟動經費項目（2015-56-05）；重慶工商大學學生科技創新基金項目（153001）

張杰（1988—），男，講師，博士，研究方向為資源綜合利用。E-mail：ctbuzj150108@ctbu.edu.cn

邵承斌（1956—），男，研究員，碩士，研究方向為資源綜合利用。E-mail：shaocb@ctbu.edu.cn