鹿結核病診斷技術研究新進展

郝景鋒，張秀峰，劉立明，張宇航，崔永鎮，李心慰，劉國文

（1.吉林農業科技學院動物科技學院，吉林 吉林132101 ；2.中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所，黑龍江 哈爾濱150030；3.吉林大學動物醫學學院，吉林 長春130062）

鹿結核病（Deer tuberculosis）是一種慢性、消耗性人獸共患傳染病，對養鹿業危害巨大，梅花鹿等多個鹿種均可感染本病，嚴重制約著養鹿業的健康發展。現有研究表明，牛型結核分枝桿菌（Mycobacterium bovis）是鹿結核病的主要病原體，隨著養鹿業的快速發展，作為對鹿養殖業危害巨大的鹿結核病越來越受到社會的重視和關注。但鹿結核病的診斷一直沒有規定性標準，鹿結核病診斷方法主要參照牛結核病的診斷，現將各種診斷方法匯報如下。

1 臨床診斷

鹿結核病是一種慢性、消耗性疾病，臨床主要表現為漸進性消瘦，食欲下降，精神沉郁，被毛雜亂失去光澤，皮膚彈性下降，結核菌主要侵害呼吸系統，主要表現為呼吸困難，張口呼吸，氣喘，先干咳后濕咳，胸部聽診時出現干性、濕性啰音或胸膜摩擦音，母鹿可出現空懷或產弱胎，公鹿生茸量降低，甚至不產茸。本病病程通常較長，可長達數月甚至數年，死于衰竭。臨床癥狀診斷雖然快捷，但不是很精確，只能作為診斷參考。

2 病理解剖學診斷

在經過流行病學調查以及必要的臨床診斷基礎上，病理解剖是診斷鹿結核病一種常用并且較為可靠的方法，鹿結核病主要病變在于肺部以及淋巴結，在肺縱隔、腸系膜、乳房等部位出現粟粒至豌豆大小不等的結核結節，甚至互相融合，變成大的干酪樣壞死，初期較為堅硬，后期柔軟，觸之如生面團樣感，切開腫大的淋巴結，流出大量黃白色且無異味的膿汁，漿膜結核由于大小相似，呈透明或者半透明狀，形如珍珠，俗稱“珍珠腫”。

3 病原學診斷

對于鹿結核病的病原學診斷包括染色鏡檢和病原培養后分離鑒定。

根據鹿發生結核的不同部位采集病料，主要采集腦脊液、痰液、膿汁、胸水、腹水、糞便以及尿液等病料，直接或經過集菌后涂片檢查，集菌的方法有離心沉淀或稀釋飄浮法等，經抗酸染色后在顯微鏡下觀察，菌體細長略彎曲，球桿狀，呈紅色，直徑0.4 μm，長1～4 μm，無鞭毛，不形成芽孢，傳統認為無莢膜，最新研究證實結核分枝桿菌的細胞壁外有一層莢膜。由于在制片過程中受到破壞，故觀察不到。若先用明膠處理樣本，可防止莢膜由于脫水而收縮。在電鏡下可看到菌體外有一層較厚的透明區，即莢膜，具有一定的保護作用。

4 結核菌素試驗診斷

結核菌素試驗是鹿結核病診斷的一種非常重要方法，也是世界衛生組織（WHO）推薦、在世界各地普遍使用的結核病常規診斷方法，它是基于Ⅳ型變態反應原理的一種皮膚試驗。結核菌素試驗可為接種卡介苗及測定免疫效果提供依據。

5 血清學診斷

鹿結核病血清學診斷被公認為一種比較確實的診斷技術，目前應用較多的血清學診斷包括酶聯免疫吸附試驗（ELISA）、干擾素診斷法、斑點免疫金滲濾法以及免疫印跡法。

5.1 酶聯免疫吸附試驗（ELISA） Engvall 和Perlman 1971 年首次報道建立酶聯免疫吸附試驗，由于ELISA 具有快速、簡潔、敏感、易于標準化等優點，迅速得到發展并廣泛應用。1976 年ELISA 診斷正式應用于結核病患者抗體檢測[1]，一直作為結核菌素試驗診斷的必要補充，ELISA 方法眾多，診斷技術不斷完善，間接ELISA 法目前在結核病診斷中應用廣泛，王啟軍等對鹿結核病間接ELISA 診斷試劑盒開展了廣泛的實驗研究，成功制備了兔抗鹿酶標抗體[2]。對結核菌素純蛋白衍生物（PPD）、KNO3以及KCl 等浸出抗原進行了系統的篩選，從而為成功研制出鹿結核病間接ELISA 診斷試劑盒奠定了基礎。

5.2 r 干擾素診斷法 γ干擾素釋放試驗分析技術IGRA（interferon-γ release assay ，IGRA）是一種用于結核桿菌感染的體外免疫檢測的新方法。

PPD 與非結核分枝桿菌（Nontuberculosis mycobacteria，NTM）和卡介苗（Bacillus Calmette-Guérin，BCG）有成分交叉[3]，易導致“假陽性”，因此，在普遍接種卡介苗地區（如我國），對結核菌素皮膚試驗（TST）陽性結果的判定需謹慎。近年來，一種診斷結核病的免疫學新方法-γ 干擾素釋放分析（IGRA）逐漸被推廣并應用于臨床。IGRA 利用結核分枝桿菌而非牛分枝桿菌BCG 株系表達的抗原刺激外周血單核產生IFN-γ。檢測血樣于12～18 h 后判定試驗結果，在2011 年以前，全球只有英國和澳大利亞兩種γ干擾素釋放試驗（IGRA）試劑盒被批準使用[4]，2011 年7 月，我國研發生產的IGRA 試劑盒(A.TB)正式獲國家食品藥品監督管理局批準。因為具有高敏感性和高特異性，并且不受卡介苗和大多數非致病分枝桿菌的影響，IGRA 在結核診斷中對實驗設備、操作人員以及實驗條件要求較高，因此在廣大基層無法大范圍推廣使用。

5.3 斑點金免疫滲濾測定法 1971 年Faulk 和Taytor 將膠體金引入免疫化學，此后斑點金免疫滲濾測定法（dot immunogold filtration assay，DIGFA）作為一種新的免疫學方法，在生物醫學各領域得到了日益廣泛的應用。斑點免疫金滲濾測定法作為免疫膠體金技術中重要組成部分在結核病診斷中發揮著重大的作用。吳波等研究表明，用DIGFA 檢測結核分枝桿菌抗體對肺結核的診斷，具有敏感性高、特異性強等特點，操作簡便、快捷，與涂片法、培養法和PCR 相比，對肺結核診斷有明顯的優勢，具有較高的應用價值[5]。但DIGFA 在實際研究及應用過程中仍存在一些不足之處：首先，在檢測過程中常出現假陰性和假陽性問題。其次，檢測的重復性及靈敏程度仍然有待于提高，檢測的范圍需要進一步拓展。

5.4 免疫印跡法 免疫印跡法（Western blotting）是一種將高分辨率凝膠電泳和免疫化學分析技術相結合的雜交技術。免疫印跡法具有特異性強、敏感性高等特點，廣泛應用于新抗原的鑒定以及抗體的聯合檢測，該法目前技術比較規范，分辨率高、特異性強、可適合大樣本檢測，具有較強的應用前景。

6 結核病感染鹿的實驗模型

建立感染實驗模型的方法可解決自然感染結核病傳播以及流行速度慢、養殖試驗動物花費巨大甚至可能造成人畜共患發生等一系列研究自然發病規律的不便，現實意義重大，建立感染實驗模型對于結核病病原學、發病機制、深入診斷研究是十分必要的，此項技術在國外已有應用，但在國內目前此項技術沒有報道，McNair J 于2001 年將102-104CFU 菌株通過鹿扁桃體感染，研究表明其病理變化與自然感染病例十分相似[6]，Griffin 于1995-1999 年通過鹿扁桃體攻毒試驗，研究表明，10-1CFU 劑量牛型結核菌通過扁桃體感染，52%以上鹿癥狀明顯，102CFU 劑量牛型結核菌對100 多只鹿進行多次感染，研究發現90%以上實驗動物出現癥狀，由于該法對鹿損傷過大，產生的經濟損失太大，因此目前應用較多的是小組實驗法（N=10-15）[7]，有報道顯示，目前美國學者通過建立感染實驗模型的方法研究白尾鹿結核病。

7 分子生物學診斷

應用分子生物學技術檢測結核分枝桿菌，克服了傳統檢測方法的諸多不足，能夠對難以培養、生長緩慢的結核分枝桿菌進行更加快速、特異、敏感、準確的鑒定與分析，對于結核病的防控起到了其他方法無法替代的作用。結核病常規的分子生物學診斷技術有聚合酶鏈式反應（PCR）、DNA 指紋技術、生物芯片技術以及核酸探針技術等。

7.1 PCR 檢測法 在應用分子生物技術檢測鹿結核病中目前最常見和適合使用的方法就是聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR），1985 年美國Muliis 等發明PCR，Young 等建立了結核桿菌基因文庫，成功地分離、鑒定結核桿菌抗原蛋白編碼基因。1989 年PCR 技術首次應用于結核病診斷，該項技術靈敏度高、特異性強，很快得到極大的肯定和廣泛應用，Ritelli 等將從巨噬細胞系中分離培養的分枝桿菌進行收集培養后，采用半巢氏PCR 檢測牛結核分枝桿菌中的特異性插入片段IS6110，判定是否含有牛型結核分枝桿菌[8]。Aderem A 等1999年利用2個長度為20個堿基的寡核苷酸引物PCR擴增編碼牛結核分枝桿菌分泌蛋白MPB70 的目標基因，擴增產物為372 bp 長度DNA 片段，此產物可通過瓊脂糖凝膠電泳檢測到，且特異性強[9]。劉桂香等用結核分枝桿菌引物對12 份鹿的組織樣本進行PCR檢測，結果11份出現陽性反應，陽性率為91.6%，細菌培養物1 份為陽性[10]。劉思國等根據已發表的牛型結核分枝桿菌的pncA 基因序列，設計特異性引物并擴增出了大小為294 bp 的目的片段，成功地構建了牛結核分枝桿菌特異性檢測的PCR 方法[11]，取得了令人滿意的效果。

7.2 DNA 指紋技術 DNA 指紋是指完全具有個體特異的DNA 多態性，其個體識別能力足以與手指指紋相媲美，可用來進行個人識別及親權鑒定，同人體核DNA 的酶切片段雜交，獲得了由多個位點上的等位基因組成的長度不等的雜交帶圖紋，這種圖紋是獨一無二的，故稱為“DNA 指紋”。此技術通常用于菌種鑒定，從而可以調查結核病的暴發流行，檢測結核病病原菌來自體內還是體外再感染、病原菌敏感性檢查等流行病學方面的研究，當前主要應用的有DRE-PCR、Spoligotyping、IS6110-PCR 以及PCR-RELP 等[12]。

7.3 生物芯片技術 生物芯片技術是通過縮微技術，根據分子間特異性地相互作用的原理，將生命科學領域中不連續的分析過程集成于硅芯片或玻璃芯片表面的微型生物化學分析系統，以實現對基因、細胞、蛋白質及其他生物組分的快速、準確、大信息量的檢測，是目前分子生物學最前沿的技術[13]，按照芯片上固化的生物材料的不同，可以將生物芯片劃分為基因芯片、蛋白質芯片、細胞芯片和組織芯片。

7.4 核酸探針法 核酸探針（Nuclear Acid Probe）是指用放射性或非放射性物質標記已知的DNA或RNA 片段。核酸探針技術最大優勢是特異性強，已在不同種群結核桿菌鑒定和結核病診斷上的許多方面顯示出重要的應用價值和應用前景。在結核病診斷中應用的核酸探針技術主要有寡核苷酸探針、全染色體DNA 探針、RNA 或cDNA 探針及PCR 擴增片段探針[14]。

綜上所述，本文從病理學、細菌學、免疫學以及分子生物等方面系統地論述了鹿結核病診斷技術的最新研究進展，不同時期不同的診斷技術都發揮了至關重要的作用，對于不同的診斷技術應該根據實驗條件、診斷目的和具體情況綜合考慮并全面分析，隨著分子生物的不斷進步，相信不久的將來鹿結核病的診斷技術會越來越規范統一，為鹿養殖業的健康發展發揮重要作用。

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