偶氮染料與蛋白質(zhì)相互作用的分子光譜法研究

張耀光

（吉林大學(xué)科教儀器廠，吉林 長春 130061）

熒光是一種光致發(fā)光現(xiàn)象，由于分子對光的選擇性吸收，不同波長的入射光便具有不同的激發(fā)效率。如果固定熒光的發(fā)射波長而不斷改變激發(fā)光的波長，并記錄相應(yīng)的熒光強度，所得的熒光強度對激發(fā)波長的譜圖稱為熒光的激發(fā)光譜。如果使激發(fā)光的波長和強度保持不變，而不斷改變熒光的測定波長并記錄相應(yīng)的熒光強度所得到的熒光強度對發(fā)射波長的譜圖則為熒光的發(fā)射光譜。激發(fā)光譜反映了在某一固定的發(fā)射波長下所測量的熒光強度對激發(fā)波長的依賴關(guān)系；發(fā)射光譜反映了在某一固定的激發(fā)波長下所測量熒光的波長分布。激發(fā)光譜和發(fā)射光譜可以鑒別熒光物質(zhì)，并作為熒光測定時選擇合適的激發(fā)波長和測定波長的依據(jù)。熒光體發(fā)光首先要吸收光，即熒光體要有吸光的結(jié)構(gòu)［1］。分子發(fā)光分析法具有如下特點：靈敏度高、選擇性比高、試樣量小、操作簡便、工作曲線的動態(tài)線性范圍寬。由于發(fā)光檢測的高靈敏度，以及發(fā)光光譜、發(fā)光強度、發(fā)光壽命等各種發(fā)光特性對研究體系的局部環(huán)境因素的敏感性，因此，發(fā)光分析法在光學(xué)分子傳感器以及在生物醫(yī)學(xué)、藥學(xué)和環(huán)境科學(xué)等方面的應(yīng)用更顯示了它的優(yōu)越性［2］。

紫外-可見分光光度法是分子吸收光譜法，涉及分子的價電子在不同分子軌道間能級的躍遷，對應(yīng)的光譜范圍為200～800nm。紫外-可見吸收光譜包括紫外吸收光譜（200～400nm）和可見吸收光譜（400～800nm）。紫外-可見分光光度法主要用于分子的定量分析，但紫外光度法為四大波譜之一，是鑒定許多化合物，尤其是有機化合物的重要定性工具之一。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，結(jié)合現(xiàn)代的光、電和計算機技術(shù)，紫外-可見分光光度法具有靈敏度高、準確度好、儀器價格低廉、操作簡便快速等優(yōu)點，使紫外-可見分光光度法在有機化學(xué)、生物化學(xué)、藥品分析、食品檢驗、醫(yī)療衛(wèi)生、環(huán)境保護、生命科學(xué)等各個領(lǐng)域和科研生產(chǎn)工作中成為一種重要的檢測手段［3］。當用熒光偏振光激發(fā)熒光分子時，熒光分子發(fā)射偏振光。這種偏振發(fā)射是由熒光分子對激發(fā)光子的取向引起的。實驗測得的熒光通常是消偏振的。其中最具有研究意義的是由于熒光分子在激發(fā)態(tài)壽命期間發(fā)生旋轉(zhuǎn)運動而引起發(fā)射消偏振。Perrin 早在1926年就報道過熒光偏振的原理，而Weber進一步拓展了熒光偏振的理論。熒光偏振測定已廣泛地應(yīng)用于生命科學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、藥物分析和環(huán)境科學(xué)等領(lǐng)域。近年來，有不少關(guān)于熒光偏振的研究與應(yīng)用的綜述發(fā)表。熒光偏振理論將熒光分子看成是一個振蕩偶極子（oscillating dipole），有內(nèi)在的吸收偶極矩（absorption dipole moment）和發(fā)射偶極矩（emission dipole moment），也稱吸收躍遷矩（moment for absorption transi tion）和發(fā)射躍遷矩（moment for emission transition）。由于熒光分子的電子基態(tài)和電子激發(fā)態(tài)的電子分布不同，熒光分子的吸收偶極矩和發(fā)射偶極矩通常是不共線的。吸收偶極矩和發(fā)射偶極矩之間的夾角對每個熒光分子而言是由分子結(jié)構(gòu)決定的。當用非偏振光激發(fā)熒光分子時，熒光分子優(yōu)先吸收那些光子電矢量（E）與熒光分子的吸收偶極矩（M）平行的光子［4］。

蛋白質(zhì)是生命的最基本物質(zhì)之一，它與營養(yǎng)、發(fā)育、遺傳、新陳代謝等生命活動等密切相關(guān)，牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）在血漿中是含量較為豐富，是最重要的載體蛋白，具有存儲和轉(zhuǎn)運內(nèi)源性和外源性代謝產(chǎn)物的重要生理功能。因為蛋白質(zhì)中含有絡(luò)氨酸和色氨酸，所以它在紫外線照射下會發(fā)出紫外線熒光，因此可以進行熒光測定。蛋白質(zhì)與某些熒光染料作用，有時會使染料的熒光強度增強，但有時也會使染料的熒光強度減弱，這些都視染料的自身性質(zhì)而定，但均可用于蛋白質(zhì)的檢測。并且由于其干擾少、快速、靈敏度高、準確、實用性高而發(fā)展很快，引起研究者的密切關(guān)注。

麗春紅S（Ponceau S）（又名猩紅S，酸性紅112）是一種帶負電荷，可以與帶正電荷的氨基酸殘基結(jié)合，在水中的溶解度為10 g/L的偶氮染料。

本文以牛血清白蛋白為血液中生物大分子的代表，在模擬生理條件下（pH=7），應(yīng)用熒光偏振技術(shù)，采用熒光光譜法、紫外-可見分光光度法，研究麗春紅S 與牛血清白蛋白相互作用的光譜，對進一步探討麗春紅S 對蛋白質(zhì)染色機理具有一定的意義。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

LS-55熒光分光光度計（美國，PE公司）；UV-2550紫外分光光度計（日本島津，日本）；F-7000 熒光分光光度計（日本，日立公司）；電子天平：（AB135-S，Switzerland），100ul微量進樣器，移液管，10ml具塞刻度試管20支；BSA固體（Sigma），麗春紅S（上海撫生實業(yè)有限公司），磷酸二氫鈉，磷酸氫鉀，實驗用水均為三次水，所用試劑均為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 配置PBS緩沖溶液（pH=7.4 0.01M）

（1）用電子天平準確秤取0.0241g磷酸二氫鈉，0.2316g磷酸氫鉀，將其溶于水中，轉(zhuǎn)移到100ml容量瓶中，定容，搖勻。

（2）用PH試紙將其調(diào)至pH=7。

1.2.2 配置BSA母液（C=1mg/ml）

（1）用電子天平準確稱取25 mg BSA固體，將其溶于水中，轉(zhuǎn)移到25 ml棕色容量瓶中，定容，搖勻。

（2）取BSA 母液0.25ml 將其置于25ml 棕色容量瓶中，定容，搖勻。得到BSA溶液的濃度為10g/ml。（實驗所用BSA濃度均為10g/ml）。

1.2.3 配置工作液（麗春紅S）母液（C=1 mM）

（1）用電子天平準確稱取0.3800g麗春紅S固體，將其溶于水中，轉(zhuǎn)移到50ml棕色容量瓶中，定容，搖勻。

（2）取上述母液5ml將其置于50ml棕色容量瓶中，定容，搖勻。得到麗春紅S溶液的濃度為100M。

（3）取100M 的溶液0.5ml 將其置于50ml 棕色容量瓶中，定容，搖勻。得到麗春紅S溶液的濃度為1M。

1.2.4 配置一系列濃度梯度的樣品溶液

溶液濃度依次為1nM、2nM、5nM、10nM、20nM、50nM、100nM、200nM、500nM、1M、2M、5M、10M、20M、50M、100M。

1.3 熒光光譜的測定

1.3.1 確定最大Ex、Em的波長

（1）測BSA 的Ex、Em 光譜確定最大Ex、Em 的波長。（Ex=280nm，Em=349nm）

（2）以測BSA的參數(shù)測PBS的Ex、Em光譜。

（3）按濃度由低到高依次換上1.2.4中配置的BSA-染料溶液并測其Em光譜。

1.3.2 測定FP

（1）測定BSA的FP。

（2）按濃度由低到高測定1.2.4中配置的BSA-染料樣品的FP。

1.3.3 在紫外區(qū)測定麗春紅S的熒光強度。

1.4 紫外光譜的測定

配置一系列樣品溶液（0—3M）并稀釋至10ml；設(shè)置儀器參數(shù)，進行光譜掃描。

2 實驗結(jié)果與討論

2.1 最大Ex、Em波長的確定

實驗結(jié)果顯示，BSA的最大Ex=280nm、Em=349nm。

2.2 麗春紅S對牛血清白蛋白內(nèi)源性熒光的猝滅

牛血清白蛋白分子中含有的氨基酸，如色氨酸（Tyr）、酪氨酸（Trp）和苯丙氨酸（Phe）殘基，能夠發(fā)射熒光，因而牛血清白蛋白是內(nèi)源性熒光物質(zhì)。由于牛血清白蛋白的內(nèi)源熒光可能發(fā)生Tyr至Trp的轉(zhuǎn)移，當激發(fā)光波長為280nm 時，牛血清白蛋白熒光發(fā)射峰位置在349nm附近。隨著麗春紅S濃度增加，熒光峰強度有規(guī)律地降低，但在圖1 中熒光峰的位置沒有發(fā)生特別明顯的移動，說明麗春紅S 與牛血清白蛋白的相互作用沒有引起蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的明顯改變，因此產(chǎn)生的是內(nèi)源性熒光猝滅。

圖1 BSA+麗春紅S發(fā)射光譜

CBSA=10ug/ml、從上到下麗春紅S濃度依次為：1：0、2：1nM、3：5nM、4：20nM、5：50nM、6：100nM、7：200nM、8：500nM、9：1μM、10：2μM

2.3 麗春紅S的濃度與吸光度的關(guān)系

用紫外可見吸收光譜研究麗春紅S的濃度與吸光度的關(guān)系，分析發(fā)現(xiàn)，隨著麗春紅S 濃度的增加，吸光度值逐漸增加。在280nM左右的吸收峰是BSA的吸收峰。在350nM、530nM 左右的吸收峰是麗春紅S+BSA 的吸收峰。實驗中所用溶液濃度：麗春紅S+BSA 的濃度（3:0.2 M，4:0.5M，5:3M）；麗春紅S+PBS的濃度（系6:3M）1：PBS

2.4 麗春紅S 的濃度對熒光偏振強研究麗春紅S F0/F-C關(guān)系

實驗發(fā)現(xiàn)，隨著麗春紅S 的濃度的增加，F(xiàn)0/F 呈增強的趨勢。（F0是BSA的熒光強度，F(xiàn)是麗春紅S+BSA的熒光強度）。麗春紅S 濃度依次為：20nM、50nM、100nM、200nM、500nM、1000nM、2000nM

得出關(guān)系式F0/F=0.0011C+1.1435

3 結(jié)論

（1）通過熒光光譜發(fā)現(xiàn)，一系列不同濃度的麗春紅S溶液，隨著麗春紅S 濃度的增加，熒光峰強度減弱，出現(xiàn)了熒光猝滅現(xiàn)象。說明麗春紅S能對牛血清白蛋白內(nèi)源性熒光產(chǎn)生猝滅作用。實驗中若不加入BSA，只加入麗春紅S和PBS，不論是在可見光區(qū)還是在紫外區(qū)熒光強度均很小，說明麗春紅S自身的熒光強度很小。

（2）在紫外可見吸收光譜中隨著麗春紅S 濃度的增大，吸光度逐漸增強；當麗春紅S 濃度相同時，只有麗春紅S的吸光度值比麗春紅S+BSA的吸光度值大。

（3）當麗春紅S 的濃度在0-2000nM 范圍內(nèi)，隨著麗春紅S的濃度的增加，其熒光偏振強度（F0/F）呈增強的趨勢。

［1］許金鉤，王尊本.熒光分析法［M］.北京:科學(xué)出版社，2006:7-8.

［2］分析化學(xué)下冊［M］.北京：高等教育出版社，2007:207.

［3］孫鳳霞，儀器分析［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2004:13.

［4］許金鉤，王尊本.熒光分析法［M］.北京:科學(xué)出版社，2006：184-185.