一種新的活動精子濃度計數方法

李福平，劉博

（四川大學華西第二醫院，成都 610041）

精子濃度為評價男性生育能力最重要的指標之一，但由于各實驗室使用檢測方法不同，實驗室結果有很大的變異。WHO 推薦的方法為精液標本經過稀釋，通過血球計數板進行計數，但發現該方法檢測結果變異較大［1］。隨著Makler板的發明和計算機的普及，計算機輔助精液分析系統（CASA）是當前最方便和常用的方法［2］，由于CASA 濃度測定由系統軟件決定，檢測的重復性和一致性較人工計數方法有很大的提高，但參數選擇范圍大，對非精子成分識別能力差，因此，準確性也會存在一定范圍的偏差［3］。隨著男科實驗室質控的不斷發展，已知濃度的乳膠珠溶液逐漸應用于精液濃度檢測的質控，但精子是具有運動功能的特殊細胞，質控珠可以對計數板和重復性操作進行很好的控制，但它不能完全模擬人工或CASA 計數精子的過程，沒有真正實現精子濃度檢測的質量控制［4-5］。所以精子濃度的檢測方法需要進一步地發展和提高，筆者根據多年的臨床精液檢測經驗，將人工計數和CASA 相結合，總結了一個快速、準確和方便的可供臨床使用的精子濃度計數方法，稱為“定格法”，并與手工計數和CASA 分析系統進行比較。

一、材料與方法

1.精液標本：均來自本院男性不育門診的患者，納入標準為精液參數均高于參考值低限（WHO第五版［6］）的標本。患者禁欲2～7d，通過手淫收集全份精液樣本，放入37℃孵箱，待精液液化后進行以下4種方法精子計數。

2.計數工具：使用的計數板為Makler（Sefi-Medical Instrument，Haifa，以色列），池深10μm，可以反復使用的精子計數池。CASA 系統為清華同方圖像檢測分析系統（CASAS-QH-III），BX-41 光學顯微鏡（Olympus公司，日本）。

3.活動精子CASA 計數法：精液液化后立即進行檢測，將5μl混勻精液滴入Makler板，CASA 系統計數2次，取平均值表示計數結果。

4.活動精子人工快速計數法：在精液液化后，取5μl混勻精液滴入Makler計數板，可與CASA同步進行。根據精子分布情況，在20倍物鏡下快速計數Makler板任意10格，即為精子濃度。

5.活動精子定格法計數法：取混勻的精液5μl，滴入Makler計數板，可與CASA 同步進行。Makler計數板中央有100個0.1mm×0.1mm 的小方格，利用CASA 的視頻采集功能，分別在Makler計數板上小方格區域的四角和中央采集5幀圖像，在修正菜單中通過肉眼計數精子個數（圖1），隨著計數精子格子數的增加，濃度準確性也會增高，按下列公式計算精子濃度：

圖1 定格法精子計數示意圖

6.制動精子人工計數法：根據《WHO》第五版推薦精子濃度檢測方法，根據本實驗室情況進行略微修改。為了減少稀釋標本和反復取樣帶來的誤差，直接將檢測完后的標本放入65 ℃水浴滅活5min，混勻后加入Makler板計數精子濃度。

二、結果

1.活動精子定格法與制動精子人工計數比較

兩種方法數據經過Kolmogorov-Smirnov正態性檢驗，P 值均大于0.05，可認為近似正態分布。定格法與制動精子人工計數結果顯示差異無統計學意義（P＞0.05），并且有好的相關性（相關系數r＝0.810，P＜0.001）（表1）。

表1 活動精子定格法與制動精子人工計數比較

2.活動精子計數的3種方法比較

比較活動精子定格法、CASA 計數法和人工快速計數法，3種計數方法體現了良好的一致性，3種方法結果沒有顯著性差異（P＞0.05）。CASA 計數法與定格法比較，有極好的一致性（r＝0.957，P＜0.001）。同樣經過定格法培訓合格后的工作人員采用人工快速計數法計算結果有良好的一致性（r＝0.924，P＜0.001）（表2）。

表2 不同活動精子計數方法的比較

三、討論

精子計數為精液常規分析中最重要的指標之一，現在WHO 推薦的方法為精液經過稀釋制動后，利用血液計數板進行計數［6］。但該方法由于計數板的局限性和精液處理步驟繁多，導致結果重復性較差，且技術池深為0.1mm，精子往往處于不同的焦平面上，造成計數結果的誤差［7］。隨著檢測技術發展，精液專用計數板如Makler板等的應用和普及，同時出現了CASA，使用精液原液直接進行精子濃度和活動百分率檢測變為現實，且在分析精子運動方面也顯示了獨特的功能［8］。CASA 系統是通過光電原理，自動得到精子濃度、活力等指標，并能對精子運動軌跡特征畸形分析，CASA 有較好的重復性和一致性，是當前臨床最常用的檢測方法［9］。然而，由于其參數選擇范圍較大，對精子與非精子成分識別能力較差，會將顆粒與精子相近的雜質當做精子計數，往往導致檢測結果有大的偏差。隨著對男科實驗室質量控制的認識越來越高，現有的質控方法如使用標準乳膠珠溶液作為質控珠，可以檢測計數板，混勻和加樣等操作進行質量控制，但其不能完全模擬CASA 計數精子的過程，無法達到整個精子計數過程的監控。

對于精子計數方法的研究，近年大部分學者主要集中在對不同計數板對精子計數的影響，如蔡靖等［10］報道了Makler、Leja和Microcell 3種不同類型的計數池對精子濃度結果存在明顯的差異。還有人工計數與儀器自動計數之間的對比研究，如紀冰［11］比較了常用計數板與ISAS檢測系統之間的差別，胡毓安等［12］報道了3種計數板與CASA 分析系統之間的比較。以上方法各有優缺點，均無法完全被代替。在選用合格的計數板后，如何得出真實、準確的精子濃度仍然沒有行之有效的方法。如前所訴，精液稀釋制動后計數方法，操作流程多，工作量大，結果受操作者主觀影響大，不適合臨床常規檢測開展。使用精液原液人工快速計數，雖然方便快捷，但與檢測者的熟練程度有很大相關，受操作者的主觀影響更大，結果往往產生較大的變異。本研究總結的“定格法”正是在通過結合人工計數和CASA分析系統的各自特點后提出的較為有效的活動精子計數方法。原理就是利用CASA 的視頻采集功能在Makler計數板視野范圍不同區域分別采集圖像，通過人工識別精子并進行計算，得出精子濃度。計數的格子越多，準確性越高。在本研究中，定格法與制動精子人工計數比較沒有顯著性差別（P ＝0.178），表明利用活動精子直接計數可以代替流程較為繁瑣的制動后精子計數。用該方法對CASA 參數進行矯正，人工計數快速計數進行培訓，可以使多種檢測精子方法得到較高的一致性和重復性（定格法-CASAr＝0.957，定格法-人工快速計數r＝0.924）。

定格法不需對標本進行稀釋和對精子制動，直接使用精液原液進行檢測，同時減少了稀釋和多次加樣帶來的誤差。定格法可與CASA 和人工快速計數同時進行檢測，檢測條件完全相同，可以對常用的幾種方法進行相互比較，相互補充。該方法簡便快速，在有CASA 檢測系統的實驗室均可開展，便于推廣。由于該方法只限于加樣后如何計數精子濃度的過程，無法避免由于取精不完整、計數板差異、混勻不充分和加樣等帶來的系統誤差。定格法是對現有的精子濃度檢測方法的補充和完善，該方法的有效性和實用性還需要多中心，大樣本量的進一步的研究。

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［9］ 姜建平，鄭為平，馬錦洪.計算機輔助精液分析系統與人工檢測精液結果的比較［J］.中華男科學雜志，2004，10：634-635.

［10］ 蔡靖，曾勇，宋成，等.3種精子計數池在計算機輔助精液分析系統中的質量評價［J］.中華男科學雜志，2009，15：241-243.

［11］ 紀冰.3種精子計數方法的比較［J］.檢驗醫學與臨床，2010，7：1752-1753.

［12］ 胡毓安，陸金春，呂年青，等.4種精子計數方法的研究［J］.中華男科學雜志，2006，12：222-224.