子宮內(nèi)膜異位癥合并不孕者STAT3基因多態(tài)性分析

黃蓉，陳亦欣，王玲，許世艷，宋麗杰，王沙燕

（1.深圳市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，深圳 518020；2.深圳市人民醫(yī)院腫瘤研究所，深圳 518020；3.深圳市人民醫(yī)院法醫(yī)物證中心，深圳 518001）

子宮內(nèi)膜異位癥（EMs），即有生長功能的內(nèi)膜組織出現(xiàn)在宮體肌層以外的部位［1］。EMs是育齡期婦女多發(fā)病，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，其發(fā)生率為6%～10%［2］，而在不孕癥婦女中，EMs的發(fā)生率更是高達(dá)45%～50%［3］。異位內(nèi)膜周期性出血會(huì)導(dǎo)致育齡期女性不孕［4］。有研究表明［5］，EMs的發(fā)病機(jī)制與患者的在位內(nèi)膜特征有關(guān)，即基因差異所致的內(nèi)膜差異導(dǎo)致了EMs的發(fā)生。近年來，隨著生命科學(xué)的飛速發(fā)展，發(fā)現(xiàn)單核苷酸多態(tài)性（SNP）是導(dǎo)致不同個(gè)體間遺傳差異的主要原因［6］。此外，EMs的發(fā)病與腫瘤的發(fā)病轉(zhuǎn)移十分相似，都表現(xiàn)出細(xì)胞的惡性增殖和血管的新生等過程。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子-3（STAT3）存在于多種細(xì)胞組織中，與細(xì)胞的增殖、分化、侵襲和凋亡等密切相關(guān)［7-8］。本研究采用限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)（PCRRFLP）對(duì)兩組婦女進(jìn)行STAT3基因多態(tài)性檢測，以探討其與子宮內(nèi)膜異位癥合并不孕癥發(fā)病機(jī)制之間的關(guān)系。

資料與方法

一、研究對(duì)象

選取2013年6月至2014年6月深圳市人民醫(yī)院收治的子宮內(nèi)膜異位癥合并不孕癥婦女30例，作為病例組；選取同期體檢健康的婦女35例，作為對(duì)照組。年齡21～35歲，平均年齡（24.53±3.55）歲，漢族。兩組研究對(duì)象，年齡和民族等一般資料比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），具有可比性。所有研究對(duì)象術(shù)前均未行激素治療，此外沒有其他內(nèi)科合并癥。本研究嚴(yán)格遵守赫爾辛基人體醫(yī)學(xué)研究倫理，所有研究對(duì)象均在知情同意并簽署知情同意書的情況下參與研究。

二、研究方法

1.主要儀器和試劑：凝膠成像儀（BioRad，美國），基因擴(kuò)增儀（Eppendorf，德國），TaqDNA 聚合酶（Invitrogen，美國），HaeⅢ內(nèi)切酶、Taqman SNP試劑盒（Takara，日本），PCR 引物由上海生工生物公司提供。

2.取樣和DNA 提取：在無菌操作下，采集病例組及正常對(duì)照組婦女外周靜脈全血5 ml，加入內(nèi)置有0.85 ml枸櫞酸鈉的試管中，混勻后保存于4℃冰箱備用。采用蛋白酶K 消化-飽和氯化鈉鹽析法提取兩組對(duì)象外周靜脈血中白細(xì)胞的DNA。

3.STAT3多態(tài)性位點(diǎn)選擇：根據(jù)HapMap 數(shù)據(jù)庫中STAT3基因的中國北方漢族人群的數(shù)據(jù)，利用Haploview 軟件，通過htSNPs（haplotype tag singlenucleotide polymorphisms）的方法對(duì)STAT3基因上的SNP 位點(diǎn)進(jìn)行篩選，最終確定了rs2293152多態(tài)性位點(diǎn)。篩選標(biāo)準(zhǔn)：①所選SNP 雜合度應(yīng)大于8%；②選擇具備內(nèi)切酶位點(diǎn)，酶切產(chǎn)物能經(jīng)電泳分離的SNP；③所選SNP 位點(diǎn)存在可用于PCR 引物的序列。

4.PCR-RFLP檢測基因多態(tài)性：據(jù)文獻(xiàn)［9］調(diào)研，引物為5’-TCCCCTGTGATTCAGATCCC-3’，3’-CATTCCCACATCTCTGCTCC-5’。PCR 擴(kuò)增參數(shù)：94℃預(yù)變4 min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，循環(huán)30 次，最后72℃延伸10min。擴(kuò)增結(jié)束后，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，采用BioRad凝膠成像儀觀察并分析結(jié)果。取PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，用HaeⅢ內(nèi)切酶酶切。酶切產(chǎn)物進(jìn)行5%的瓊脂糖凝膠電泳，采用BioRad凝膠成像儀觀察并分析結(jié)果。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。兩組率比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、SATA3（rs2293152）位點(diǎn)PCR 產(chǎn)物驗(yàn)證

PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分析，可見單一特異性目的片段，未見其它非特異性片斷混雜。rs2293152位點(diǎn)PCR 產(chǎn)物長度為233bp，與理論產(chǎn)物長度相符。

二、STAT3基因多態(tài)性分布比較

STAT3基因rs2293152 多態(tài)性位點(diǎn)的3 種基因型為CC／CG／GG。C 和G 等位基因頻率在觀 察 組 和 對(duì) 照 組 分 別 為70.0%、30.0% 和90.0%、10.0%，兩者相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。觀 察 組CC 純 合 型17 例，CG 雜 合型8例，GG 純 合 型5 例，分 別 占 總 數(shù) 的56.7%、26.7%和16.6%；對(duì) 照 組CC 純 合 型30 例，CG雜 合 型3 例，GG 純 合 型2 例，分 別 占 總 數(shù) 的85.7%、8.6%和5.7%。兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表2）。此外，與CC 基因型相比，攜帶G 等位基因的基因型（CG＋GG）可能增加了子宮內(nèi)膜異位合并不孕癥的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)［OR＝4.59，95%CI（1.40，15.09）］。

圖1 SATA3（rs2293152）位點(diǎn)PCR 產(chǎn)物電泳圖

表1 觀察組和對(duì)照組婦女等位基因頻率比較［%（n）］

表2 觀察組和對(duì)照組婦女STAT3基因型分布［n（%）］

討 論

EMs是育齡期婦女多發(fā)病，異位內(nèi)膜周期性出血會(huì)導(dǎo)致育齡期女性不孕。大量研究表明，EMs的發(fā)病具有家族遺傳性，提示EMs可能是一種多基因遺傳病［10］。所以，探討EMs合并不孕癥的遺傳易感基因具有十分重要的臨床意義。通過文獻(xiàn)調(diào)研，我們發(fā)現(xiàn)STAT3與EMs的發(fā)病存在一定的相關(guān)性。有研究表明，EMs患者異位內(nèi)膜組織STAT3的水平明顯高于在位內(nèi)膜［11］。此外，STAT3 還參與了對(duì)子宮內(nèi)膜蛻膜化的調(diào)控，從而對(duì)受孕起著重要作用［12］。STAT3存在于多種細(xì)胞組織中，能夠通過對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄的調(diào)控而影響一系列基因的表達(dá)，如對(duì)cyclin D1、bcl-xL、VEGF和bcl-2等的表達(dá)，STAT3參與了細(xì)胞的增殖、分化、侵襲和凋亡等過程［13-14］。不同個(gè)體間基因組序列只存在極小的遺傳差異，最常見的就是SNPs。SNPs是人類基因組脫氧核糖核酸序列中十分常見的變異形式，決定了不同個(gè)體對(duì)疾病易感性和藥物反應(yīng)的差異。有報(bào)道指出，STAT3基因rs2293152多態(tài)性位點(diǎn)與多種疾病相關(guān)。謝佳新等［15］通過對(duì)1 021例肝細(xì)胞癌患者的研究，發(fā)現(xiàn)rs2293152多態(tài)性可能增加了肝細(xì)胞癌的患病風(fēng)險(xiǎn)。本研究通過對(duì)30例子宮內(nèi)膜異位癥合并不孕癥婦女STAT3基因rs2293152多態(tài)性位點(diǎn)的研究，發(fā)現(xiàn)觀察組和對(duì)照STAT3 基因rs2293152多態(tài)性位點(diǎn)的C、G 等位基因頻率存在顯著性差異（P＜0.05）；三種基因型CC／CG／GG 在觀察組和對(duì)照組的分布也存在明顯差異（P＜0.05）；此外，與CC基因型相比，攜帶G 等位基因的基因型（CG＋GG）可能增加了子宮內(nèi)膜異位合并不孕癥的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。研究結(jié)果提示STAT3 基因rs2293152多態(tài)性可能與子宮內(nèi)膜異位癥合并不孕癥的遺傳易感性相關(guān)。

［1］ 涂飛霞，阮菲，吳瑞瑾，等.STAT3 和SOCS3 與子宮內(nèi)膜異位癥的相關(guān)性研究［J］.中國病理生理雜志，2012，28：152-154.

［2］ 覃秋萍.腹腔鏡治療輕型子宮內(nèi)膜異位癥合并不孕癥的臨床觀察［J］.中外醫(yī)學(xué)研究，2013，11：46-47.

［3］ Okamoto M，Nasu K，Abe W，et al.Enhanced miR-210 expression promotes the pathogenesis of endometriosis through activation of signal transducer and activator of transcription 3［J］.Hum Reprod，2015，30：632-641.

［4］ 孟津，趙敏，金海紅，等.磷酸化STAT3和Bcl-2在子宮內(nèi)膜異位 癥 的 表 達(dá) 及 相 互 關(guān) 系［J］.河 北 醫(yī) 藥，2012，34：1933-1935.

［5］ 黃凱丹，婁可心，夏雷，等.STAT3基因多態(tài)性與大腸癌發(fā)病易感性的關(guān)聯(lián)性研究［J］.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2014，30：770-772.

［6］ 王玲，黃蓉，許世艷，等.STAT3蛋白在子宮內(nèi)膜異位癥合并不孕患者中的表達(dá)及臨床意義［J］.臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2015，14：104-106.

［7］ Nam S，Wen W，Schroeder A，et al.Dual inhibition of Janus and Src family kinases by novel indirubin derivative blocks constitutively-activated Stat3 signaling associated with apoptosis of human pancreatic cancer cells［J］.Mol Oncol，2013，7：369-378.

［8］ 孟津，金海紅，姜麗，等.P-STAT3在子宮內(nèi)膜異位癥中表達(dá)的初步研究［J］.河北醫(yī)藥，2011，33：3409-3411.

［9］ 劉懿，余德才，潘明潔，等.STAT3及XRCC4基因多態(tài)性與肝細(xì)胞癌易感性的關(guān)系研究［J］.國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2014，35：850-852.

［10］ 趙美，姜斌.靶向STAT3 的核酸類抑制劑治療腫瘤的研究進(jìn)展［J］.中國腫瘤生物治療雜志，2011，18：230-234.

［11］ Klein R，Stiller S，Gashaw I.Epidermal growth factor upregulates endometrial CYR61expression via activation of the JAK2／STAT3pathway［J］.Reprod Fertil Dev，2012，24：482-489.

［12］ Itoh F，Komohara Y，Takaishi K，et al.Possible involvement of signal transducer and activator of transcription-3in cell-cell interactions of peritoneal macrophages and endometrial stromal cells in human endometriosis［J］.Fertil Steril，2013，99：1705-1713.

［13］ 劉琴，李海，徐松，等.STAT3與SOCS3在子宮內(nèi)膜腺癌中的表達(dá)及生物學(xué)行為的相關(guān)性分析［J］.臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2013，12：1350-1352.

［14］ Oh HK，Choi YS，Yang YI，et al.Leptin receptor is induced in endometriosis and leptin stimulates the growth of endometriotic epithelial cells through the JAK2／STAT3and ERK pathways［J］.Mol Hum Reprod，2013，19：160-168.

［15］ 謝佳新，殷建華，張琪，等.JAK／STAT 信號(hào)通路中關(guān)鍵分子基因多態(tài)性與肝細(xì)胞癌易感性的關(guān)系［J］.中華流行病學(xué)雜志，2012，33：87-91