一氧化氮抑制劑對(duì)金黃地鼠體外囊胚培養(yǎng)中囊胚孵出的影響

楊愛(ài)軍，王雪楠，潘曉燕，于春娜，郝翠芳

（1.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院，青島 266071；2.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，濟(jì)寧 272029；3.吉林醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，吉林 132013）

以IVF-ET 為代表的輔助生殖技術(shù)（ART）是治療不孕不育癥的重要手段，在IVF-ET 的常規(guī)治療中，一般移植2～3個(gè)第3天的胚胎，目前臨床妊娠率只有30%～45%［1］，并易引起多胎妊娠。為了提高妊娠率和降低多胎妊娠的風(fēng)險(xiǎn)，單囊胚移植逐漸受到世界各國(guó)生殖中心的關(guān)注［2］。在正常囊胚的孵化過(guò)程中，其必須先分泌許多蛋白酶，消化透明帶產(chǎn)生小缺口，擴(kuò)張囊胚才能經(jīng)此缺口孵出，這些組織蛋白酶稱為“破殼蛋白”［3］。蛋白酶分泌量的多少對(duì)于擴(kuò)張囊胚的孵出至關(guān)重要。

Fong等［4］的研究表明，體外培養(yǎng)的囊胚約有54%的囊胚不能從透明帶中孵出，因此降低了胚胎的著床率。為提高囊胚的孵化率，雖已采用多種輔助孵化技術(shù)，但其對(duì)胚后期發(fā)育造成了許多不良影響：激光輔助孵化可能會(huì)因其熱效應(yīng)而影響胚胎發(fā)育；化學(xué)法對(duì)胚胎有毒，其使用的酸性Tyrodes溶液對(duì)分裂中期囊胚細(xì)胞的紡錘絲有毒害作用［5］。因此，提高受精囊胚的自然孵化率是解決問(wèn)題的關(guān)鍵。一氧化氮（NO）作為調(diào)控胚胎發(fā)育的重要信號(hào)分子，通過(guò)旁分泌和自分泌的形式調(diào)控著胚胎各階段的發(fā)育。Sireesha等［6］發(fā)現(xiàn)地鼠囊胚分泌的組織蛋白酶P和L（cathepsin P和cathepsin L）在囊胚孵化過(guò)程中起著重要的作用，組織蛋白酶的表達(dá)被抑制可直接阻止囊胚的孵化。因此，闡明組織蛋白酶表達(dá)分泌的調(diào)控途徑，將會(huì)有效地控制擴(kuò)張囊胚的孵化。Liao等［7］研究表明中性粒細(xì)胞分泌組織蛋白酶的功能受NO／cGMP通路的調(diào)控，說(shuō)明NO／cGMP信號(hào)通路在調(diào)控囊胚的發(fā)育過(guò)程中起了重要作用，但對(duì)囊胚孵化的作用尚缺乏研究。

本研究將探討NO 與囊胚孵化率的關(guān)系以及組織蛋白酶mRNA 的表達(dá)與囊胚孵化的關(guān)系，為提高囊胚自然孵化率尋找實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雌性金黃地鼠，8～12周齡，20只；雄性金黃地鼠，10～13周齡，20只；由長(zhǎng)春高新醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供；清潔級(jí)條件下飼養(yǎng)1 周后用于實(shí)驗(yàn)。飼養(yǎng)條件為：溫度為20～22℃，濕度為40%～60%，光照周期（白天光照14h，夜間黑暗10h）。自由飲水取食。

二、試劑

孕馬血清（PMSG）和絨毛膜促性腺激素（HCG）均購(gòu)買(mǎi)于寧波第二激素廠；Trizol（Invitrogen life technologies公司，美國(guó)）；DEPC（AMRESCO E174，美 國(guó)）；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas 公 司，立 陶 宛）；SYBR Premix Ex Taq kit試劑盒（TaKaRa公司，大連）；引物由華大基因合成；L-NAME（Sigma公司，美國(guó)），其它試劑均購(gòu)買(mǎi)于Sigma公司。

三、實(shí)驗(yàn)方法

1.卵母細(xì)胞的體外受精和受精胚的體外培養(yǎng)：陰道涂片連續(xù)觀察3個(gè)發(fā)情周期正常，于發(fā)情前期對(duì)雌性地鼠進(jìn)行超排處理，腹腔注射HCG 20U／只，15h后脫頸椎處死，分離輸卵管，清洗后撕開(kāi)膨大部，收集卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體（COCs）于人輸卵管液（HTF）滴盤(pán)中。10～13周齡的雄性地鼠，頸椎脫臼處死后，連同附睪一起取出睪丸，分離出精子，放入HTF獲能液中獲能，調(diào)整精子濃度為（0.5～1）×106個(gè)／ml，精卵共孵育6h后，將受精卵（光學(xué)顯微鏡下觀察到雙原核）移入平衡好的KSOMAA液滴中清洗3次，對(duì)照組將受精卵置入M199培養(yǎng)液中，實(shí)驗(yàn)組在M199培養(yǎng)液中添加10 mmol／L 一氧化氮合酶抑制劑（L-NAME），37℃、5%CO2的飽和濕度條件下培養(yǎng)96h，統(tǒng)計(jì)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組囊胚的孵化率（囊胚的孵化率＝孵化的囊胚數(shù)／總的囊胚數(shù)），統(tǒng)計(jì)囊胚細(xì)胞總數(shù)。

2.測(cè)定NO 的產(chǎn)生量：收集兩組D4的胚胎培養(yǎng)液，取20μl培養(yǎng)液測(cè)定NO 的濃度，每組測(cè)定20個(gè)液滴，按照NO 測(cè)定試劑盒的方法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算培養(yǎng)液中NO 的含量［8］，采用NO 測(cè)定試劑盒，利用傳統(tǒng)的Griess法檢測(cè)。

3.統(tǒng)計(jì)囊胚的細(xì)胞總數(shù)：收集囊胚，對(duì)囊胚細(xì)胞核進(jìn)行熒光染色，統(tǒng)計(jì)囊胚的細(xì)胞總數(shù)。

4.組織蛋白酶mRNA 表達(dá)水平檢測(cè)：收集兩組D4 的囊胚，用Trizol提取細(xì)胞總RNA，對(duì)總RNA 進(jìn)行純度、濃度及完整性測(cè)定，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。引物由primer5.0 軟件設(shè)計(jì)，組織蛋白酶L（cathepsin L）和cathepsin P的引物序列如表1所示（由華大基因合成）。用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（SYBR Green法）進(jìn)行擴(kuò)增，實(shí)驗(yàn)操作按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。擴(kuò)增循環(huán)程序?yàn)椋?5℃5 min；（95℃30s，55℃30s，72℃30s），35個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣品一個(gè)重復(fù)。實(shí)時(shí)定量PCR（Real Time PCR）反應(yīng)體系為：2×Real Master Mix 10.0μl，上游引物1μl，下游引物1μl，DNA 模板1.8μl，超純水6.2μl，總體積20μl。組織蛋白酶mRNA 表達(dá)水平檢測(cè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)次數(shù)是4次，樣本量是50枚胚胎。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、NO 的代謝水平對(duì)囊胚的孵化率和孵化質(zhì)量的影響

與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組囊胚培養(yǎng)液中NO 的產(chǎn)生量顯著降低（P＜0.05），并且實(shí)驗(yàn)組中囊胚孵化率以及囊胚的總細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組相比顯著降低（P＜0.05）（表2）。

二、組織蛋白酶mRNA 的表達(dá)

cathepsin L及cathepsin P mRNA 在實(shí)驗(yàn)組囊胚中的表達(dá)量低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表3）。

表1 Real-time PCR引物序列

表2 兩組的NO 產(chǎn)生量、囊胚孵化率、囊胚細(xì)胞總數(shù)的比較（±s）

表2 兩組的NO 產(chǎn)生量、囊胚孵化率、囊胚細(xì)胞總數(shù)的比較（±s）

注：與對(duì)照組相比，P＜0.05

組 別 例數(shù) NO 的產(chǎn)生量（μmol／L） 囊胚孵化率（%） 囊胚的細(xì)胞總數(shù)（個(gè)）80 7.2±0.7 78.2±2.6 47.0±3.5實(shí)驗(yàn)組 80 4.5±0.5＊ 23.5±4.7＊ 31.0±4.1對(duì)照組＊

表3 兩組cathepsin L和cathepsin P mRNA 在囊胚中的表達(dá)（±s）

表3 兩組cathepsin L和cathepsin P mRNA 在囊胚中的表達(dá)（±s）

注：與對(duì)照組相比，＊P＜0.05

組 別 例數(shù) cathepsin L／β-actin cathepsin P／β-actin對(duì)照組80 0.70±0.08 0.86±0.12實(shí)驗(yàn)組 80 0.25±0.07＊ 0.35±0.05＊

討 論

NO 作為調(diào)控胚胎發(fā)育的重要信號(hào)分子，在囊胚的發(fā)育過(guò)程中起了重要作用［7，9］，NO 對(duì)植入前 囊胚的作用是通過(guò)cGMP信號(hào)通路起作用的。Tranguch等［10］研究表明代謝NO 水平高的胚胎具有高的囊胚發(fā)育率和種植率。本實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)組添加NOS抑制劑L-NAME后，NO 的產(chǎn)生量明顯降低，囊胚的孵化率以及囊胚細(xì)胞的總數(shù)也明顯減少。因此推測(cè)囊胚孵化率降低可能是由于NO 的產(chǎn)生量減少而導(dǎo)致的，NO 產(chǎn)生量的降低會(huì)影響胚胎的發(fā)育潛能。

囊胚的成功孵出是IVF-ET 手術(shù)妊娠的一個(gè)重要因素，孵出失敗會(huì)降低輔助生殖技術(shù)的成功率。正常的體內(nèi)受精胚發(fā)育到囊胚階段后，囊胚分泌的組織蛋白酶將透明帶消化使囊胚得以孵出，種植入子宮內(nèi)膜，從而獲得正常妊娠。因此組織蛋白酶在囊胚的孵化和著床的過(guò)程中起著重要的作用［11］。有研究表明中性粒細(xì)胞分泌組織蛋白酶的功能受NO／cGMP通路的調(diào)控［7］。本研究結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組加入NOS 的抑制劑水平明顯降低，因此推測(cè)L-NAME可能通過(guò)下調(diào)cathepsin L 和cathepsin P的表達(dá)降低囊胚孵化率，從而引起胚胎著床失敗。Sireesha等［12］也在金倉(cāng)鼠囊胚透明帶和滋養(yǎng)層檢測(cè)到cathepsin L 和cathepsin P 的 表 達(dá)，抑 制cathepsin L和cathepsin P 的表達(dá)可阻斷囊胚孵化，說(shuō)明cathepsin L和cathepsin P的表達(dá)量在囊胚的孵化過(guò)程中起著重要的作用。本實(shí)驗(yàn)與其結(jié)果一致，說(shuō)明cathepsin L 和cathepsin P 在囊胚的孵化過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。

Sharma等［13］研究表明中性粒細(xì)胞分泌組織蛋白酶的功能受NO／cGMP 通路的調(diào)控，NO／cGMP通路在組織蛋白酶的分泌過(guò)程中起了重要作用。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明：L-NAME 抑制NO 的產(chǎn)生，有可能是通過(guò)NO／cGMP信號(hào)通路，降低cathepsin L和cathepsin PmRNA 的表達(dá)水平，最終導(dǎo)致囊胚孵化率的降低。

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