無孔兩性離子交換色譜固定相的制備及其應用

鄭慶忠，卜春苗，龔波林

（1.寧夏大學化學化工學院，寧夏銀川 750021；2.寧夏大學天然氣轉化國家重點實驗室培育基地，寧夏銀川 750021）

高效液相色譜（HPLC）已發展成為分離和分析生物大分子的強有力手段。在色譜分離時，減少分離時間來保持蛋白的生物活性是非常必要的[1]，無孔類型的快速高效液相色譜固定相應運而生。這類填料的主要優點是其克服了傳統多孔填料中的停滯流動相傳質，由于顆粒小，剛性好，對改善柱效，提高樣品的質量回收，保持溶質的生物活性十分有利，特別適合于生物大分子的分離與快速分析[2-3]。

兩性離子色譜材料是一種在同一材料內同時存在陰陽兩種交換基團，被廣泛應用于分離分析無機陰陽離子[4-5]。首次報道的兩性交換材料用于蛋白質的分離是Jiang[6]通過化學鍵合法將兩性基團鍵合到大孔硅膠表面，可同時分離酸性和堿性蛋白，效果較好，但其存在的弊端是以硅膠為基質，大大限制了其pH 應用范圍。

本文是在已有的研究[7]基礎上，以自合成的3.0 μm無孔單分散親水性PGMA/EDMA微球為基質，通過新的化學鍵合法制備得到了一種兩性離子交換色譜填料（ZIC）。詳細考察了ZIC 型固定相的分離性能，流速等對蛋白質保留的影響。實驗結果表明，該填料是一種性能優異的離子交換樹脂，能同時分離酸性和堿性，特別適合于生物大分子的快速分離純化。

1 實驗部分

1.1 ZIC 樹脂的合成

稱取3.0 g 無孔PGMA/EDMA（微球I）樹脂放入100 mL三頸瓶中，加入到40 mL 的二甲胺溶液中，60 ℃回流反應20 h。產物用水、丙酮和乙醇反復洗滌，真空60 ℃，得微球II。將微球II 分散于120 mL 的乙睛中，并加入2.5 g 1，3-丙磺酸內酯，于80 ℃回流攪拌24 h，產物用丙酮和乙醇洗滌數次，真空干燥，即可制得一種新型的兩性離子交換色譜填料（Zwitterionic exchange packings，ZIC）（微球III），合成路線（見圖1）。

1.2 ZIC 填料的裝填

以水為勻漿液，在28 MPa 壓力下以勻漿法裝柱，不銹鋼柱管：5×0.46 cm I.D.。

1.3 色譜測試條件

10 min 線性梯度（100 %A～100 %B），流動相：A 液（平衡液）：20 mmol/L LPBS（pH=5），B 液（洗脫液）：A+1.0 mol/L NaCl（pH=5），檢測波長：280 nm。

1.4 前沿色譜法測定ZIC 填料的動態吸附容量

使用5×0.46 cm I.D.的ZIC 柱，在流動相為20 mmol/L PBS+1.5 mg/mL Lys（BSA），流速為0.5 mL/min 的條件下，采用前沿突破曲線法，測定了該ZIC 柱填料的動態吸附容量。

1.5 快速分離純化重組人粒細胞-巨嗤細胞集落刺激因子（rhG-CSF）包涵體

rhG-CSF 包涵體的提取：稱取一定量的rhG-CSF菌體，加入一定量緩沖液，在冰浴條件下超聲波破碎儀破碎菌體，4 ℃，18 000 r/min 離心15 min，棄去上清液，收集包涵體。按體積比為包涵體質量：7 mol/L Gu·HCl=1：30 的比例，研磨，加入7.0 mol/L Gu·HCl 溶液。在4 ℃攪拌放置17 h 后，18 000 r/min 離心15 min，取上清液直接用所合成的ZIC 色譜分離純化rhG-CSF。

2 結果及討論

2.1 ZIC 柱色譜性能的考察

為了考察在本論文中所制備的ZIC 柱的色譜性能，在pH=5.0 的緩沖體系中，運用制備的ZIC 柱，選取等電點pI 大于7.0 堿性蛋白：Myo（pI 7.3），RNase-A（pI 8.8），Cyt-C（pI 9.4），Lys（pI 11.0），及pI 小于7.0 酸性蛋白：BSA（4.9），OVA（4.7）和Ins（5.3）作為目標物質來驗證其在ZIC 柱上的保留行為，最終驗證酸性蛋白和堿性蛋白在ZIC 柱上均有保留。這是由于在本論文中所合成的ZIC 樹脂表面帶有磺酸基與氨基，在合適的色譜條件下，分別能與堿性和酸性蛋白發生靜電作用而保留，符合兩性色譜柱的特性。圖2 可以證明，在合適的條件下，ZIC 柱可以對4 種堿性蛋白達到基線分離（見圖2）。

圖1 ZIC 色譜填料的合成路線

圖2 標準蛋白在ZIC 柱上的分離圖（5×0.46 cm I.D.）

2.2 ZIC 柱對蛋白的快速分離

在本實驗中，選取無孔填料為基質，其存在的最大優勢是顆粒度小，特別有利于生物大分子在其表面快速傳質，從而能達到快速分離。圖3（b）中可以看出，ZIC 柱在流速為2 mL/min 時，4 min 內可達到對4 種堿性蛋白的基線分離。與圖3 中（a）相比較可以看出，柱效與1 mL/min 時的柱效基本相同，實驗證明所合成的無孔填料，具備了高效和快速分離的特征。

2.3 ZIC 填料的動態吸附容量

圖3 蛋白在ZIC 柱上的分離圖

對于分離技術中大規模制備的需要，動態吸附曲線能夠為分離介質的動力學鍵合量提供有價值的信息。所以本論文中通過測定填料的動態吸附容量來評價色譜柱的分離純化性能具有一定的意義。本文選用Lys（流動相：20 mmol/L NaH2PO4+1.5 mg/mL Lys，流速為0.5 mL/min）和BSA（流動相：20 mmol/L NaH2PO4+1.5 mg/mL BSA，流速為0.5 mL/min）為考察蛋白，測定所合成的ZIC 填料的動態吸附容量。實驗結果得出在突破點為5%時，該ZIC 填料的動態吸附容量BSA為26.4 mg/mL，Lys 為37.6 mg/mL，結果比較滿意（見圖4）。

2.4 ZIC 柱應用研究

人粒細胞-巨嗤細胞集落刺激因子（G-CSF）屬于造血生長因子，主要來源于巨嗤細胞、內皮細胞及纖維母細胞。發酵表達所得的重組人粒細胞-巨嗤細胞集落刺激因子（rhG-CSF）與大量的雜蛋白混雜在一起，增加了復性和分離純化的難度。rhG-CSF 的等電點為6.0，適宜于運用本實驗中選合成的ZIC 柱進行純化。用ZIC 柱對rhG-CSF 樣品進行了一步分離純化的色譜圖（見圖5）。圖5 中目標峰（*）為rhG-CSF，純度由純化前的30 % 提高到87 %。實驗證明，用所合成的ZIC 柱，選擇合適的色譜條件，rhG-CSF 和其他蛋白得到了很好的分離，純化后的rhG-CSF 具有較高的純度。表明所合成的ZIC 柱具有優良的兩性離子交換色譜性能，可以滿足對生物大分子的分離純化。

圖4 BSA 和Lys 吸附量測定突破曲線圖

圖5 快速分離純化重組人粒細胞-巨嗤細胞集落刺激因子的色譜圖（*為rhG-CSF）

3 結論

離子交換色譜法具有廣泛的應用范圍，特別是在分離生物大分子分離純化中具有重要的意義。本文以3.0 μm 無孔單分散PGMA/EDMA樹脂為基質，用新的化學改性方法合成了一種親水性良好的兩性離子交換色譜（ZIC）填料。結果表明，所報道的ZIC 柱可達到同時對酸性和堿性蛋白的保留，并適宜于對蛋白的快速分離純化。

［1］ Sun Guoyong，Shi Qinghong，Sun Yan. J Chromatogr. A，2004，1061：159.

［2］ 趙慶香，閻虎生，何炳林.高效液相色譜的動力學增強填料［J］.離子交換與吸附，1998，14（3）：275.

［3］ 楊樹明，田秀蘭，蘇天升.非多孔樹脂的高效液相色譜填料及其對蛋白質的分離性能［J］.分析化學研究報告，1997，25（2）：130.

［4］ Sugrue E，Pavel N，Nesterenko，et al. Fast ion chromatography of inorganic anion and cations on a lysinebonded porous silica monolith［J］.J Chromatogr A，2005，1075：167-175.

［5］ Twohill E，Paull B. Zwitterionic ion chromatography using a dynamically coated column and mobile phase recycling［J］.J Chromatogr A，2002，973：103-113.

［6］ Jiang Wand Irgum K.Synthesis and Evaluation of Polymer-Based Zwitterionic Stationary Phases for Separation of Ionic Species［J］.Anal. Chem，2001，73：1993-2003.

［7］ Zhu Jinxia，Bo Chunmiao，Gong Bolin. Preparation of Strong Cation Exchange Packings Based on Monodisperse Hydrophilic Non-porous Resins and Their Application for Fast Separation of Proteins［J］.China J Chromatogr，2006，24（2）：129-134.