鐵皮石斛莖尖誘導原球莖再生體系的研究

王波　崔翠　顧穎慧

摘 要 以鐵皮石斛莖尖為外植體進行高效再生體系建立實驗，采用單因素實驗研究不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基、激素濃度的配比、天然添加物對原球莖誘導、增殖、分化的影響，篩選出適合各培養(yǎng)階段的培養(yǎng)體系配方，建立鐵皮石斛組織培養(yǎng)快速繁殖體系

關(guān)鍵詞 鐵皮石斛；原球莖誘導；快繁體系

中圖分類號：S682.31 文獻標志碼：B 文章編號：1673-890X（2015）18-00-03

鐵皮石斛（Dendrobium candidum），又稱黑節(jié)草，云南鐵皮，蘭科多年生附生草本植物，道家養(yǎng)生經(jīng)典著作《道臧》譽其為“中華九大仙草之首” [1]。由于人們對野生鐵皮石斛的過度采挖，使得其野生資源已瀕臨滅絕，而鐵皮石斛的種子極小且無胚乳，自然條件下萌發(fā)率極低，實生苗人工栽培相對比較困難；并且傳統(tǒng)的分株、扦插等繁殖方式生長周期長，繁殖率低，遠不能滿足生產(chǎn)上的需要[2]。為此，開展鐵皮石斛的組織培養(yǎng)研究成為必然。目前，有關(guān)鐵皮石斛組織培養(yǎng)成功的報道很多[3]。在鐵皮石斛再生體系技術(shù)研究中，原球莖誘導是整個再生的體系中開始的環(huán)節(jié)，其誘導率的高低直接影響瓶苗的出苗率、生產(chǎn)成本。本研究以鐵皮石斛無菌苗作為外植體，對莖尖誘導原球莖的增殖和分化進行系統(tǒng)研究，以基礎(chǔ)培養(yǎng)基、激素的濃度配比和天然添加物為因子，采用正交試驗篩選出最優(yōu)的培養(yǎng)基配方，以期縮短組培苗生長周期、提高組培苗質(zhì)量和移栽成活率，為人工規(guī)模化繁殖和栽培提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

選用濰坊工程職業(yè)學院花卉研究所培育的鐵皮石斛無菌苗作為組織培養(yǎng)的外植體材料

1.2 實驗方法

選取健壯無污染的組培苗，在解剖鏡下仔細剝離莖尖，逐層剝?nèi)ネ鈬M織，用解剖刀切取0.1～0.2 mm的莖尖，分別接種到誘導培養(yǎng)基中，經(jīng)過一段時間的誘導，外植體膨大產(chǎn)生原球莖。將產(chǎn)生的原球莖轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基和分化培養(yǎng)基，經(jīng)原球莖的增殖和分化形成新的植株。人工氣候培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：溫度（25±1）℃，濕度為75%，光照強度為2 000 lx，時間12 h/d。

2 結(jié)果與分析

2.1 原球莖的誘導

以莖尖為外植體誘導原球莖的發(fā)生階段做三因素三水平正交試驗（表1），將切取的莖尖接種到不同配方的培養(yǎng)基中，每瓶接種4個莖尖，每個處理接種5瓶，重復3次。基本培養(yǎng)基：MS+7.5 g/L瓊脂+30 g/L蔗糖，pH值5.8。培養(yǎng)期間定期觀察原球莖誘導情況，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計誘導率。對照不加激素和天然添加物，試驗結(jié)果表明（表2），在不添加激素和天然添加物時，外植體的誘導率為13.3%，當添加不同濃度的激素和天然添加物后原球莖的誘導率均有所上升。并且極差分析表明在所設(shè)置的3個因素中6-BA對試驗結(jié)果的影響比較明顯，其次為天然添加物椰肉和NAA。綜合分析極差結(jié)果，該試驗最佳培養(yǎng)基配比為：MS+0.2 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA+10 g/L椰乳+7.5 g/L瓊脂+30 g/L蔗糖。

表1 L9（34）正交試驗因素水平設(shè)計

因素

水平 A B C

NAA/（mg/L） 6-BA//（mg/L） 椰肉/（g/L）

1 0.1 0.2 5

2 0.2 0.5 10

3 0.5 1.0 15

表2 L9（34）正交試驗結(jié)果分析

試驗號 A B C 誘導率/%

CK 0 0 0 13.3

1 1 1 1 31.7

2 1 2 2 41.7

3 1 3 3 35.0

4 2 1 3 31.7

5 2 2 1 43.3

6 2 3 2 38.3

7 3 1 2 31.7

8 3 2 3 35.0

9 3 3 1 35.0

K1 108.4 95.1 110 -

K2 113.3 120 116.7 -

K3 101.7 108.3 91.7 -

k1 36.1 31.7 36.7 -

k2 37.8 40.0 38.9 -

k3 33.9 36.1 33.9 -

R 3.9 8.3 5.0 -

2.2 原球莖的增殖

將上述試驗中相同條件下生長良好的原球莖，切割成直徑約1.0 cm×1.0 cm小塊接種到不同激素和天然添加物配比的培養(yǎng)基中，每瓶接種4塊，60 d內(nèi)統(tǒng)計原球莖的增殖情況。基本培養(yǎng)基。1/2MS+7.5 g/L瓊脂+30 g/L蔗糖，pH值5.8。以NAA、6-BA、KT、椰乳為因素設(shè)計四因素三水平的正交試驗（表3）。

原球莖培養(yǎng)7 d后，增殖現(xiàn)象開始明顯，新增原球莖淡黃綠色；30 d原球莖增殖加快；60 d后部分原球莖少部分出現(xiàn)黃化現(xiàn)象。9 組試驗原球莖增殖倍數(shù)和生長狀況都出現(xiàn)差異（表4），試驗組5號、6號、9號原球莖生長緊致，顏色綠色，增殖倍數(shù)較大；試驗組1號、4號和7號原球莖的增殖倍數(shù)較低，生長后期出現(xiàn)黃化壞死現(xiàn)象。極差分析結(jié)果表明NAA、6-BA、KT、椰乳四個對試驗結(jié)果影響順序為6-BA>NAA>KT>椰乳，最適實驗組合為B2A2C2D3。綜合原球莖增殖倍數(shù)及生長狀況，增殖最適培養(yǎng)基為1/2MS+0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT+15 g/L椰乳+ 7.5 g/L瓊脂+30 g/L蔗糖。

表3 不同激素和天然添加物因素水平表

因素

水平 A B C D

NAA/（mg/L） 6-BA/（mg/L） KT 椰乳/（g/L）

1 0.2 1.0 0 5

2 0.5 1.5 0.5 10

3 1.0 2.0 1.0 15

2.3 原球莖的分化

將上述增殖試驗中生長一致且狀態(tài)健壯的原球莖，切割成直徑約1.0 cm×1.0 cm小塊接種到不同激素和天然添加物配比的分化培養(yǎng)基中，每瓶接種4塊，每種處理接5瓶，30 d統(tǒng)計原球莖的分化情況。基本培養(yǎng)基：MS+7.5 g/L瓊脂+30 g/L蔗糖，pH值5.8。以NAA、6-BA、KT、馬鈴薯提取物為測試因素設(shè)計四因素三水平的正交試驗（表5）。在設(shè)置的9組試驗中原球莖的分化出現(xiàn)了明顯的差異（表6），試驗組5號、6號原球莖分化率最大； 試驗組1號、2號和3號分化率較低。極差分析結(jié)果表明NAA、6-BA、KT、馬鈴薯提取物四個對試驗結(jié)果影響順序為NAA>6-BA>KT>馬鈴薯提取物，最適實驗組合為A2B1C2D3。原球莖最適分化培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L KT+150 g/L椰乳+ 7.5 g/L瓊脂+30 g/L蔗糖。

表5 原球莖分化培養(yǎng)基因素水平表

因素

水平 A B C D

NAA/（mg/L） 6-BA/（mg/L） KT 馬鈴薯提取物/（g/L）

1 0.5 1.0 0 50

2 1.0 1.5 0.1 100

3 1.5 2.0 0.5 150

（上接第頁）

3 結(jié)論

自然狀態(tài)下，鐵皮石斛的種子極小，繁殖率低，用組織培養(yǎng)方法快速繁殖大量試管苗，是解決種苗最有效的途徑之一[4]。本研究綜合各試驗階段初步建立了一套較完整的鐵皮石斛組織培養(yǎng)繁殖體系。以莖尖為外植體分別研究了不同激素配比和天然添加物對鐵皮石斛原球莖的誘導、增殖和分化的影響。從中比較和篩選出適合不同培養(yǎng)階段的培養(yǎng)基配方。結(jié)果表明，莖尖誘導原球莖的最適誘導培養(yǎng)基為MS+0.2 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA+10 g/L椰乳+7.5 g/L瓊脂+30 g/L蔗糖，原球莖增殖培養(yǎng)基為1/2MS+0.5 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT+15 g/L椰乳+ 7.5 g/L瓊脂+30 g/L蔗糖。原球莖分化培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L KT+150 g/L椰乳+ 7.5 g/L瓊脂+30 g/L蔗糖。在本試驗體系中原球莖的分化率最大可以達到93.3%，這為鐵皮石斛規(guī)模化生產(chǎn)提供了更加有力的保障。

參考文獻

[1][魏]吳普，等述.神農(nóng)本草經(jīng)[M].[清]孫星衍，等輯.北京：人民衛(wèi)生出版社，1982：21.

[2]徐路加，華允芬.石斛原球莖的組織培養(yǎng)研究進展[J].北方園藝，2014（6）.

[3]王麗萍，梁淑云.鐵皮石斛原球莖誘導與增殖研究[J].中國農(nóng)學通報，2010（1）.

[4]張啟香，付素靜，方炎明，等.鐵皮石斛擬原球莖的發(fā)生過程[J].浙江林學院學報，2009（3）.

（責任編輯：劉昀）