紅網紋草組織培養外植體消毒方法研究

范諸平+王立雪+張彥妮

摘 要：以紅網紋草的頂芽、葉片、莖段為外植體，對其進行最佳消毒方法的研究。首先以葉片為外植體，篩選最適宜的次氯酸鈉濃度和升汞濃度，即進行不同濃度次氯酸鈉（1%，2%，5%）和升汞（0.05%，0.10%，0.15%）的單因素試驗。繼而進行外植體（頂芽，葉片，莖段）、2%次氯酸鈉消毒時間（0，5，10 min）、0.10%升汞消毒時間（0，5，10 min）3因素3水平的L9（34）正交試驗。結果表明：在單因素試驗中，適合紅網紋草外植體的次氯酸鈉和升汞濃度分別為2%和0.10%；在正交試驗中，莖段與葉片污染率相同，均低于頂芽，但莖段成活率最高，因而為理想的外植體，最佳的消毒方法是將莖段外植體在2%的次氯酸鈉中消毒5 min，再在0.10%的升汞中消毒5 min。此種消毒方法污染率和死亡率最低為0，存活率最高為100%，是適宜紅網紋草的最佳消毒方式。

關鍵詞：紅網紋草；組織培養；消毒方法；正交試驗

中圖分類號：S682.39 文獻標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.08.029

紅網紋草（Fittonia verschaffeltii）是爵床科草本植物，葉脈紅色網紋狀，耐陰濕、喜溫暖，是一種珍貴的室內觀葉植物[1]。主要以扦插或分株法進行繁殖，因北方地區冬季氣溫低不易發根，只能在春、夏兩季育苗。由于常規方法受季節影響較大，且繁殖速度太慢，不能滿足市場需要[2]，因而可利用組織培養技術實現紅網紋草的快速繁殖。

由于紅網紋草莖段部位有較多纖毛，且葉背脈絡較深，這為其組織培養中的外植體消毒帶來一定困難，而有效的消毒方法是組織培養成功的前提和保障。不同植物材料、不同部位其消毒試劑和消毒時間不盡相同[3]。盡管近幾年來國內開展了一些關于網紋草屬的組織培養研究[1-2，4-9]，但僅局限于白網紋草[1-2，4-8]，關于紅網紋草的組織培養研究僅有1篇[9]，尚未見關于紅網紋草組織培養消毒方法的研究報道。本研究旨在篩選適宜紅網紋草組織培養的外植體、消毒試劑和消毒時間，為紅網紋草組織培養的無菌操作提供技術支持。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗材料紅網紋草購自哈爾濱市花卉市場，選取生長健壯、無病蟲害的頂芽、葉片、莖段為外植體。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體的預處理 將剪好的外植體盛裝于小燒杯中，先用洗衣粉水沖洗10 min，再用流水沖洗10 min，直至小燒杯中的洗衣粉泡沫沖洗殆盡。

在超凈工作臺上，將洗好的外植體移入已消毒的空瓶中，用75%的酒精浸泡30 s，不斷搖晃容器使外植體充分接受酒精的殺菌作用。倒出酒精，倒入無菌水涮洗1次，然后按試驗設計要求對外植體進行不同消毒試劑、不同時間的浸泡消毒。若消毒試劑為次氯酸鈉，則用無菌水沖洗3次；若消毒試劑為升汞，則用無菌水沖洗5次，以充分消除殘余升汞對外植體產生愈傷組織的抑制作用。

將已消毒的外植體置于鋪有無菌濾紙的超凈工作臺上，使其充分吸收外植體表面的水分。剪掉頂芽外植體形態學下端與消毒試劑接觸的部位，再將其剪成1 cm左右的小段；剪掉莖段外植體兩端與消毒試劑接觸的部分，再剪成1 cm左右的小段；剪掉葉片外植體四周與消毒試劑接觸的部分，再剪成1 cm2左右的小塊。將3種外植體接種于MS+6-BA 2.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1的誘導培養基（添加7.8%瓊脂、25 g·L-1蔗糖）上，調節pH值至5.8～6.0。培養室溫度25 ℃，光照強度3 000 lx，光照時間16 h·d-1。

1.2.2 單因素試驗 篩選次氯酸鈉和升汞的最適濃度：以紅網紋草葉片為外植體，設置次氯酸鈉1%，2%，5%和升汞0.05%，0.10%，0.15% 3個濃度水平的6組處理，每組處理均消毒10 min，每個處理30瓶，每瓶接種1個外植體，試驗重復3次。30 d后，統計污染率、死亡率，篩選出最適合紅網紋草的次氯酸鈉和升汞濃度。

1.2.3 L9（34）正交試驗 篩選適宜的消毒試劑和消毒時間：在單因素試驗基礎上，進行外植體（頂芽、葉片、莖段）、2%次氯酸鈉消毒時間（0，5，10 min）、0.10%升汞消毒時間（0，5，10 min）3因素3水平的L9（34）正交試驗[3]。按照表1、表2共進行9個處理，每個處理30瓶，每瓶1個外植體，試驗重復3次。30 d后，統計污染率、死亡率、成活率，進而探究出紅網紋草外植體的最佳消毒方法。

1.3 數據統計與分析

利用Microsoft excel軟件制表，統計污染率、死亡率和成活率，利用SPASS統計分析軟件進行方差分析，利用鄧肯氏多重比較（Duncans multiple-range test）檢驗其顯著性，P >0.05為變化不顯著，P <0.05為變化顯著，P <0. 01為變化極顯著[10]。

污染率=×100%；

死亡率=×100%；

成活率=×100%；

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 次氯酸鈉適宜濃度 在污染率、成活率指標上，不同濃度的次氯酸鈉處理之間差異均達到極顯著水平（P<0.01）。將外植體分別用1%，2%，5%的次氯酸鈉處理10 min，培養30 d后，進行觀察與統計，結果見表3。當次氯酸鈉濃度為2%時，其污染率為3組中最低值（33.3%），成活率為3組中最高值（66.7%），其消毒效果最佳。當次氯酸鈉濃度降低至1%時，其污染率增加，且成活率降低；當次氯酸鈉濃度升高至5%時，其污染率與成活率均降低。由此可見，2%的次氯酸鈉污染率最低，能保證較高的成活率，是適合于紅網紋草的最佳消毒濃度。

2.1.2 升汞適宜濃度 在污染率、成活率指標上，不同濃度的升汞處理之間差異均達到極顯著水平（P<0.01）。將外植體分別用0.05%，0.10%，0.15%的次氯酸鈉處理10 min，培養30 d后，進行觀察與統計，結果見表4。經縱向比較可以看出當升汞濃度為0.10%時，其污染率為3組中最低值（46.7%），成活率為3組中最高值（53.3%），其結果為最佳。當升汞濃度降低至0.05%時，其污染率上升，成活率隨之下降；當升汞濃度升高至0.15%時，雖然污染率相比較0.05%的升汞處理低，但成活率也處于較低水平。原因是升汞不易去除，高濃度的升汞殘留在外植體表面對其造成毒害作用致其死亡。由此可見，0.10%的升汞污染率最低，且對植物的毒害作用相對較小，能保證較高的成活率，是適合于紅網紋草的最佳消毒濃度。

2.2 正交試驗

2.2.1 不同外植體的消毒效果 方差分析結果表明（表5），在死亡率、成活率兩個指標上，不同外植體的消毒效果之間差異極顯著（P<0.01）。縱向比較可發現，葉片和莖段的污染率均低于頂芽，但莖段較葉片死亡率低且成活率高。顯然，以莖段作為紅網紋草的外植體是最佳選擇。

2.2.2 次氯酸鈉不同消毒時間的消毒效果 方差分析結果表明，在污染率、死亡率、成活率3個指標上，次氯酸鈉不同消毒時間的消毒效果都差異極顯著（P<0.01）。在污染率指標上，消毒時間0 min最高（表6），達到53.3%，消毒時間延長5 min，污染率明顯下降，達到15.6%，下降約37.7%。但當消毒時間繼續延長5 min，污染率略有上升，猜測是紅網紋草與次氯酸鈉的化學反應所致，但仍待進一步研究考證。當消毒時間延長至10 min時，由于次氯酸根的強氧化性致試驗材料邊緣白化以致死亡，死亡率高達43.3%，顯著高于其他兩個處理，造成試驗材料的浪費。由此可見，次氯酸鈉的最佳消毒時間為5 min。

2.2.3 升汞不同消毒時間的消毒效果 方差分析結果表明，在污染率、死亡率、成活率3個指標上，升汞不同消毒時間的消毒效果差異極顯著（P<0.01）。在污染率指標上，消毒時間為0 min時最高（表7），達到48.9%，消毒時間延長5 min，污染率明顯下降，達到21.1%，下降約27.8%。消毒時間繼續延長5 min，雖然污染率得到有效控制，但死亡率顯著上升，上升約37.8%，達到42.2%，顯著高于其他兩個處理。猜測由于植物材料長時間浸潤于升汞中，使升汞殘留外植體表面造成植物的重金屬中毒。由此可見，當升汞的消毒時間為5 min時，能保證較低的污染率和死亡率，是理想的消毒時間。

2.2.4 正交試驗 9個不同處理的消毒效果 方差分析結果表明（表8），正交試驗中9個不同處理污染率、死亡率、成活率3個指標差異極顯著（P<0.01）。經比較，在污染率和死亡率指標上，處理2均為最低值0，且其存活率達100%。在其余8組處理中，處理3的污染率也較低，但其死亡率處于最高水平73.3%，且存活率為最低水平20.0%，易造成植物材料的浪費。處理4～9中，污染率波動幅度不大，死亡率除處理4為0外，其余處理均相差不大，且在這6組中，處理4存活率最高也僅為63.3%，與處理2相比還有很大差距。由此可見，處理2（A1B2C2：次氯酸鈉處理5 min，升汞處理5 min）的污染率、死亡率最低，成活率最高，是適合紅網紋草的外植體消毒方法。

3 結論與討論

3.1 外植體的選取

保證無菌是組織培養成功的前提和后續試驗能夠順利開展的基礎，由于不同的外植體外部形態不同，因而消毒方式和消毒效果不盡相同。試驗結果表明，莖段較頂芽和葉片污染率、死亡率較低，成活率較高，且較易產生愈傷組織，消毒效果較好，因而為理想的外植體。

葉片消毒效果較差可能與葉片上纖毛較多、葉背的網脈較深，以致消毒試劑難以深入有關。頂芽是植物最幼嫩的組織器官，所攜帶的微生物量比其他器官組織相對較少，但因其過于幼嫩，又極易被殺死，難以實現污染率和死亡率的同時降低[3]。不同外植體的消毒效果不同，還可能與不同基因在不同外植體的選擇性表達、不同外植體經過消毒后產生的次生物質不同有關[11]。總之，原因較復雜，尚需進一步試驗和研究。

此外還發現，在相同激素配比的培養基中，不同的外植體產生的愈傷組織形態不同。以葉片為外植體時，在葉片邊緣和葉脈處產生白色愈傷組織；以莖段為外植體時，其形態學下端膨大產生綠色愈傷組織，莖節處芽萌發形成嫩葉；以頂芽為外植體時，頂芽下端亦膨大產生綠色愈傷組織（圖1）。原因可能為相同的外界條件下，基因在不同部位的外植體選擇性表達而產生不同的愈傷組織，仍需進一步試驗探究。

3.2 消毒試劑的選用和消毒時間的選擇

由于基因的選擇性表達，使得不同外植體的外部形態不同，因而消毒效果不盡相同。試驗結果表明，最適宜紅網紋草的消毒方式組合為A1B2C2，即將莖段外植體浸于75%的酒精中消毒30 s，倒出酒精，倒入無菌水沖洗1次，再在2%的次氯酸鈉中消毒5 min，倒出次氯酸鈉并用無菌水沖洗3次，繼而在0.10%的升汞中消毒5 min，倒出升汞并用無菌水沖洗5次。此消毒方法的污染率和死亡率最低，存活率最高，是最適合紅網紋草的消毒方式。

消毒試劑和消毒時間的選擇尤為重要。在眾多消毒試劑中，本試驗采用次氯酸鈉和升汞進行外植體的消毒，選擇適宜的時間，能夠保證較低的污染率和死亡率，是較為理想的消毒試劑。消毒的同時，消毒劑會破壞外植體的細胞，細胞出于自我保護，不斷地產生大量次生物質，若消毒時間過長，會引起細胞毒害，導致外植體褐變甚至死亡； 若消毒時間過短，外植體則會因消毒不徹底，而導致高污染率[12]。因而合理的消毒時間和消毒試劑是紅網紋草外植體良好消毒效果的保證。

由圖2可看出，在單因素試驗中，相同的培養基濃度和消毒時間，單獨采用升汞消毒的外植體產生愈傷組織的時間顯著長于次氯酸鈉，約長8 d。原因可能為升汞殘留造成外植體內部的一系列生理變化，延遲愈傷組織產生時間。

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