芒果POD基因片段的克隆及序列分析

林錦何，葉翰江

（惠州市惠陽區(qū)水果生產(chǎn)辦公室,廣東 惠州516211）

芒果POD基因片段的克隆及序列分析

林錦何，葉翰江

（惠州市惠陽區(qū)水果生產(chǎn)辦公室,廣東 惠州516211）

摘要：通過改進(jìn)的熱硼酸法提取“Keitt”品種芒果果皮中的RNA,以提取的RNA為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并以此為模板設(shè)計POD基因簡并引物,進(jìn)行RT-PCR,得到的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后與PMD-18載體連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌,任意挑選陽性克隆,進(jìn)行序列分析,得到芒果POD基因特異片段.通過DNA-Star軟件對幾種親源關(guān)系較近的物種進(jìn)行氨基酸序列同源性比對,芒果POD基因與柑桔、龍眼、可可、梨的POD基因的相似性分別為：89%、87%、88%、77%,說明克隆得到的片段為芒果POD基因片段.

關(guān)鍵詞：芒果；POD基因；cDNA克隆；序列分析

芒果（Mangifera indica L.）為漆樹科芒果屬熱帶常綠果樹,原產(chǎn)印度及馬來西亞等地區(qū),在我國主要集中分布于海南、廣東、廣西、云南等南方省區(qū).芒果由于果實味道甜美、風(fēng)味獨特而深受人們喜愛.芒果作為躍變型熱帶亞熱帶水果,采收期正值高溫多雨季節(jié),不僅會加速采后果實的完熟,而且也極易使采后果實受病原微生物的侵染導(dǎo)致腐爛,降低其耐貯性,造成較大損耗［1］.

過氧化物酶（Peroxidase,POD）基因是植物次生代謝物質(zhì)合成的關(guān)鍵基因［2］,在植物木質(zhì)素和木栓質(zhì)的合成［3-5］、參與生長素的降解［6］、參與活性氧代謝［7］、參與植物組織褐變、參與植物對外界不良脅迫的應(yīng)答［8-12］等過程中,具有許多非常重要的生理功能［13］.目前對芒果POD基因的克隆國內(nèi)尚未有相關(guān)的報道,為此,筆者通過克隆芒果POD基因,對其序列進(jìn)行了分析并與柑桔、龍眼、梨等水果進(jìn)行氨基酸序列同源性比對,為進(jìn)一步研究其在芒果中的相關(guān)研究奠定了研究基礎(chǔ).

1　材料與方法

1.1供試材料

從云南省華坪縣采摘凱特品種芒果.選取果實大小均勻,沒有機(jī)械傷害或病癥的果實,用清洗劑將芒果洗干凈晾干取芒果果皮為樣品,將樣品用液態(tài)氮冷凍后保存在 -80°C冰箱.

1.2提取芒果總RNA及mRNA的分離純化

提取芒果總RNA的方法為熱硼酸法,基本參照 Wan和 Wi1kins（1994）［14-15］的方法.mRNA的分離純化按TaKaRa Agarose Ge1DNA Purification kit試劑盒的說明書進(jìn)行.

1.3檢測mRNA濃度及完整性

用分光光度計檢測芒果總RNA含量并評價其質(zhì)量.取1μ1總芒果RNA,稀釋 100倍,測定其在260、280 nm的光吸收值并計算OD 260/OD280的比值.為進(jìn)一步評價芒果總RNA的完整性,取 10μg芒果總RNA在 1.2%濃度的瓊脂糖變性膠進(jìn)行電泳檢測［16］.

1.4POD簡并引物的設(shè)計與合成

根椐GenBank中植物的同源序列使用Primer 5.0軟件設(shè)計POD （登錄號∶EF122403；AF030132；AY301280；AF403707）基因的簡并引物.上游引物序列為5,-YAYGATTTCACYGTBAAGGA-3,,下游引物序列為5,-AAYTTKCHRAAGTTCCACTT-3,,引物由上海生工生物工程有公司合成.

1.5芒果cDNA克隆與序列分析

以提取的芒果mRNA為模板［17］,采用TaKaRa PrimeScriPtⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA,用該cDNA作為模板與POD基因的簡并引物作RT-PCR［18］.RT-PCR條件為∶94℃預(yù)變性3 min,共計32個循環(huán)（94℃變性30 sec、Tm退火30 sec、72℃延伸1 min）的反應(yīng),72℃延伸10 min.RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂凝膠電泳后,切下目的片段,用DNA凝膠回收試劑盒（Agarose Ge1DNA Purification Kit,TaKaRa）進(jìn)行回收,回收方法基本參照TaKaRa試劑盒說明書上的步驟進(jìn)行［19］.經(jīng)回收純化后與TaKaRa PMD-18載體連接、轉(zhuǎn)化進(jìn)DH5α大腸桿菌中.在LB/AMP/IPTG/X-Ga1平板上進(jìn)行陽性克隆篩選,最后隨機(jī)挑取經(jīng)EcoRⅠ/HindⅢ酶切確認(rèn)的已插入目的基因質(zhì)粒作序列分析［20］.序列分析委托上海生工生物技術(shù)有限公司完成,采用美國ABI337序列分析儀.

2　結(jié)果與分析

2.1總RNA的制備

本實驗提取的芒果總RNA純度高、質(zhì)量好,無明顯的降解,用紫外分光光度計檢測芒果總RNA的紫外吸收值A(chǔ)260/280比值約為1.80,1%瓊脂糖變性凝膠電泳結(jié)果清楚顯示18 S和28 S兩條核糖體RNA帶,并且沒有明顯拖尾現(xiàn)象（圖1所示）,說明提取的RNA,完全可用于基因克隆和半定量RTPCR等后續(xù)實驗.

圖1　芒果果皮總RNA電泳檢測

2.2RT-PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增

以合成的cDNA第一鏈為模板,以POD基因的簡并引物為引物,進(jìn)行PCR擴(kuò)增POD cDNA片段, PCR產(chǎn)物經(jīng)過含有GDview的1%瓊脂糖凝膠電泳,在紫外凝膠成像儀下觀察.圖2（a）表明泳道1在365 bP左右處有一條明亮條帶,這條條帶與預(yù)計的POD PCR產(chǎn)物的大小基本一致.對PCR擴(kuò)增得到的片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳、回收并瓊脂糖凝膠電泳回收檢測,在365 bP左右可以清楚的看到回收條帶.將回收的擴(kuò)增片段用于下一步與載體連接、轉(zhuǎn)化.在含有LB/AmP/IPTG/X-Ga1培養(yǎng)基上篩選出陽性克隆,并在藍(lán)斑周圍挑選白色的菌落進(jìn)行LB液體培養(yǎng)［21］,抽提質(zhì)粒,用EcorRⅠ/HindⅢ 進(jìn)行雙酶切和凝膠電泳檢測,結(jié)果如圖2（b）所示,在泳道1、2可以清楚的看到大小365 bP左右的條帶.

圖2　芒果電泳圖

2.3序列分析與同源性比較

測序結(jié)果顯示,該序列由365個堿基組成（圖3,Genebank登錄號為GU266282）,該核苷酸序列編碼121個氨基酸,通過DNA-Star軟件對氨基酸序列同源性比較發(fā)現(xiàn),芒果POD基因與柑桔、龍眼、可可、梨［22］的POD基因的相似性分別為∶89%、87%、88%、77%（圖4）.通過物種間基因序列相似性比對結(jié)果表明此克隆得到的目的片段為芒果POD基因片段.

圖3　擴(kuò)增片段測序結(jié)果

圖4　芒果POD基因氨基酸序列與柑桔、龍眼、可可、梨的POD基因氨基酸序列的同源性比較

3　討論

芒果果皮由于富含酚類等物質(zhì),這給RNA的提取及定量分析帶來了極大困難.經(jīng)過改進(jìn)的Wan等的熱硼法可盡可能的去除果皮中的多酚類物質(zhì),為提取高質(zhì)量的芒果總RNA提供了可能［23］.本試驗提取的芒果果皮總RNA含量較高,經(jīng)紫外分光光度計檢測OD260/OD280＞1.8,而且RNA瓊脂糖凝膠變性電泳后18 S和28 S兩條核糖體RNA帶清晰可見,可滿足cDNA克隆及RNA定量分析的要求.

已知POD在植株體內(nèi)廣泛存在,參與植物抗病性作用,該酶能在細(xì)胞壁中催化酚類前體聚合形成木質(zhì)素作為抵御病菌侵襲屏障［24］,其活性的增加,標(biāo)志著植物抗病物質(zhì)的加速合成和植物抗性的產(chǎn)生［25］；另外它也是細(xì)胞內(nèi)活性氧清除酶之一,可避免活性氧的產(chǎn)生和積累［26］.為此,本研究通過cDNA克隆出芒果POD基因,通過與柑桔、龍眼、可可、梨已確定為其POD基因進(jìn)行序列同源性比對,它們的相似性分別為∶89%、87%、88%、77%,此證明克隆得到的片段為芒果POD基因片段,從同源性比對結(jié)果來看這幾種植物中編碼的氨基酸序列具有較高的同源性而且區(qū)域間的相似性高度集中,從另一個側(cè)面也表明這幾種物種間也有較近的親源關(guān)系.POD基因特異片段的獲得為進(jìn)一步在分子水平上研究其在芒果中的相關(guān)功能、作用并且在研究物種間的進(jìn)化關(guān)系有著非常重要的意義.

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（責(zé)任編輯∶閆文龍）

中圖分類號：S667.7

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1007-5348（2015）10-0053-05

［收稿日期］2015-05-28

［基金項目］韶關(guān)市科技計劃項目（2013CX/N09）.

［作者簡介］林錦何（1985-）,男,廣東汕頭人,惠州市惠陽區(qū)水果生道辦公室農(nóng)藝師,碩士；研究方向∶果樹生理、分子生物學(xué).

Clonlng and Sequence Analysls of POD Genes ln M a ngo

LIN Jin-he,YE Han-jiang
（Huizhou City Huiyang District Fruit Production Office,Huizhou 516211,Guangdong,China）

Abstract:The study using modified hot boric acid method extracted RNA from the Pee1 of“Keitt”mango. Using PCR degenerate Primers designed with reference to the conserved amino acid sequences of known POD genes,it was to amP1ify cDNA fragments in mango fruits by RT-PCR.The Purified Product was connected with PMD-18 vector and transformed into E.co1i.The random1y se1ected Positive c1ones were Performed with sequence ana1ysis,to achieve mango sPecific fragments of mango POD gene.The homo1ogy of amino acid sequence was found through DNA-Star software,the simi1arity of mango POD gene with citrus, 1ongan,cocoa and Pear was 89%,87%,88%,77%,resPective1y.

Key words:Mango；POD Genes；cDNA c1oning；sequence ana1ysis