RamR突變協(xié)同靶位基因突變對沙門氏菌耐藥性影響的研究

付曉平 李嘉彬 蔣紅霞

(廣東科貿(mào)職業(yè)學(xué)院,廣東廣州 510430)

RamR突變協(xié)同靶位基因突變對沙門氏菌耐藥性影響的研究

付曉平 李嘉彬 蔣紅霞

(廣東科貿(mào)職業(yè)學(xué)院,廣東廣州 510430)

從實驗室保存的沙門菌中篩選出33株對環(huán)丙沙星呈現(xiàn)不同敏感程度的分離株,采用PCR方法檢測喹諾酮類作用靶位基因突變和外排泵調(diào)控基因ramA的負調(diào)控蛋白編碼基因ramR的突變。結(jié)果表明,33株沙門菌中,凡是高水平耐藥菌和環(huán)丙沙星耐藥菌株都發(fā)生GyrA和ParC的多位點突變,突變主要在gyrA和parC基因的QRDR,即GyrA發(fā)生83和87位的雙突變(S83F/D87G,8株; S83F/D87N,5株;S83L/D87N,1株),ParC發(fā)生57和80位的雙突變(T57S/S80R)。15株對環(huán)丙沙星敏感性下降的菌株中,有5株在gyrA83位發(fā)生單位點突變,有5株在87位發(fā)生氨基酸的取代(3株D87Y,2株D87N),其余4株在4個靶位基因的QRDR都沒有發(fā)生任何突變。對33株沙門菌ramR擴增測序后發(fā)現(xiàn),15株菌的ramR發(fā)生突變,共有4種突變類型,M83T(n=6),A37S(n=3),T18P (n=3)和氨基酸的缺失(n=3)。剩下的18株,無論對環(huán)丙沙星敏感/敏感性降低還是耐藥,ramR沒有檢測到任何突變。

沙門氏菌;ramR;PCR;外排泵

沙門氏菌是引起人類食源性感染疾病最主要也是最常見的病原菌，而且沙門氏菌也是重要的人畜共患病病原體[1]，而在臨床上治療由沙門氏菌引起的感染時，氟喹諾酮類一般是首選藥物，但由于臨床藥物的濫用或不合理添加使得沙門氏菌對抗生素的敏感性在不斷下降[2]。沙門氏菌對喹諾酮類的耐藥主要歸因于喹諾酮決定區(qū)基因的突變，GyrA的突變是最常見的，而且突變通常發(fā)生在83位和87位，GyrA單位點的突變通常能夠引起沙門氏菌對喹諾酮的敏感性下降，而ParC的突變通常伴隨著GyrA的突變，且能夠?qū)е律抽T氏菌對喹諾酮類藥高水平耐藥[3]。

除了由于氨基酸的替代導(dǎo)致突變引起沙門氏菌對藥物的敏感性降低外，外排泵的作用機制也是也是一個不容忽視的重要原因[4，5]。在沙門氏菌中至少存在9種多重耐藥外排泵，AcrABTolC是其中最重要的一種，它能夠主動外排多種底物，包括抗生素、染料和洗滌劑等[6，7]。有研究報道，AcrAB-TolC對氟喹諾酮藥物的主動外排作用是導(dǎo)致S.typhimurium DT204高水平耐藥的主要原因，也是導(dǎo)致S.typhimuriumDT104多重耐藥的主要作用機制[8]，RamA是沙門氏菌中誘導(dǎo)AcrAB-TolC表達的重要控制蛋白[9]。RamA表達受到負調(diào)控蛋白RamR的調(diào)控[10]。有研究報道當(dāng)ramR基因發(fā)生突變或有插入序列時，RamR的功能發(fā)生改變，引起ramA的過表達或者表達量減少[8]，從而改變菌株的耐藥表型。

本研究篩選了臨床分離的對環(huán)丙沙星呈現(xiàn)不同耐藥水平的沙門菌，探討耐氟喹諾酮類沙門菌靶位突變類型與RamR突變類型之間的關(guān)聯(lián)。

1 材料和方法

1.1 菌株

從實驗保存的沙門氏菌中篩選了33株對環(huán)丙沙星呈現(xiàn)不同耐藥水平的菌株，其中15株耐藥株（MIC，4～128μg/ml），16株敏感性降低菌株（MIC，0.06～1μg/ml），敏感株2株，質(zhì)控菌ATCC25922。各菌株耐藥分子表型特征見表1。

1.2 靶位基因和ramR基因的突變檢測

首先對菌株進行復(fù)蘇，然后采用水煮法提取細菌的總DNA，備用，參考已發(fā)表相關(guān)文獻設(shè)計、合成引物，對所有不同程度耐藥水平的菌株采用PCR方法擴增靶位基因（gyrA、gyrB、parC和parE）和ramR基因。陽性PCR產(chǎn)物送北京華大公司測序，將測序結(jié)果提呈NCBI進行序列比對，分析靶位基因和ramR的突變情況。

2 結(jié)果

2.1 33株食品動物源沙門氏菌靶位基因QRDR突變檢測

33株對環(huán)丙沙星呈現(xiàn)不同敏感性的沙門菌，靶位基因的突變主要發(fā)生在gyrA和parC基因。凡是對環(huán)丙沙星耐藥的菌株（16株）都發(fā)生GyrA和ParC雙靶位的多重突變，即GyrA發(fā)生83和87位的雙突變（S83F/D87G，8株；S83F/D87N，5株；S83L/D87N，1株），ParC發(fā)生57和80位的雙突變（T57S/S80R，11株）。而15株對環(huán)丙沙星敏感性下降的菌株中，有10株發(fā)生gyrA的單位點突變，其中有5株在83位發(fā)生S83Y（4株）和S83F（1株）突變，有5株在87位發(fā)生突變（3株D87Y，2株D87N）。有一株發(fā)生parCT57S的突變。4株在靶位基因的QRDR都沒有發(fā)生任何突變，這些沒有發(fā)生任何突變的菌株中，有三株攜帶PMQR基因。而2株對環(huán)丙沙星敏感的菌株，有一株發(fā)生gyrA靶位基因S83T的突變，且攜帶PMQR基因，一株在靶位基因未發(fā)生任何突變，也未攜帶PMQR基因。結(jié)果見表1。

2.2 ramR基因突變檢測

分析33株不同程度耐藥菌株ramR的突變情況發(fā)現(xiàn)，有15株菌ramR發(fā)生突變（8株高水平耐藥，7株敏感性下降），共4種突變類型，M83T（n=6），A37S（n=3），T18P（n=3）和氨基酸的缺失（n=3）。剩下19株，無論對環(huán)丙沙星敏感/敏感性降低還是耐藥，ramR沒有檢測到任何突變。結(jié)果見表1。

3 討論

喹諾酮類藥物為一類廣譜高效的化學(xué)合成抗菌藥，具有較強的抗菌活性，現(xiàn)已廣泛用于人醫(yī)臨床和獸醫(yī)治療感染性疾病。近幾年來，喹諾酮類藥耐藥株迅速增多，其臨床療效受到了嚴(yán)重的影響，喹諾酮類耐藥機制復(fù)雜，主要有靶位改變和主動外排兩個機制所致，這兩者均有染色體突變引起[11]。與喹諾酮類耐藥有關(guān)的gyrA的突變發(fā)生在QRDR第199-318個堿基，主要有4個突變位點，按照突變頻率分別是83位，87位，81位和84位。且有研究已經(jīng)證實QRDR的突變與細菌的耐藥有直接的關(guān)系[12]。有研究證實gyrA的基本突變位點是Ser83，且此位點的突變常常造成細菌對喹諾酮類耐藥[13]，拓撲異構(gòu)酶Ⅳ的亞單位基因的突變也是造成耐藥的一方面，其亞單位最主要的parC基因，parC和gyrA的N-末端都有與QRDR有關(guān)的區(qū)域，當(dāng)發(fā)生氨基酸替代后影響藥物與酶的結(jié)合，從而使得耐藥性增加，但拓撲異構(gòu)酶Ⅳ只是藥物的從屬靶位，parC的突變發(fā)生在Ser-80/Glu-84，并且gyrA的突變是引起細菌對喹諾酮類耐藥的主要原因，而parC的突變則可引起菌株對氟喹諾酮類藥的高水平耐藥[14]）。

本研究對33株沙門菌的靶位基因突變檢測證實了以前的研究結(jié)果，即gyrA是藥物作用的首要靶位，也是細菌產(chǎn)生耐藥性的第一步。在本研究中，有10株菌株發(fā)生gyrA單位點突變，導(dǎo)致細菌對環(huán)丙沙星的敏感性降低（MIC 0.06～1μg/ml），而gyrA和parC同時發(fā)生突變的菌株則對環(huán)丙沙星呈現(xiàn)高水平耐藥。

本研究進一步分析RamR四種突變類型與靶位基因突變機制之間的關(guān)系。RamR發(fā)生A37S突變的菌株，GyrA和ParC都發(fā)生多位點雙突變，對環(huán)丙沙星高水平耐藥；而M83T類型的突變株的大多表現(xiàn)出明顯增強的外排泵活性，其中5株在GyrA發(fā)生單位點的突變（2株在83位突變，3株在87位突變），只對環(huán)丙沙星表現(xiàn)出敏感性降低；另外有一株在GyrA和ParC都發(fā)生突變，對環(huán)丙沙星卻表現(xiàn)高水平耐藥（MIC 32μg/ml）。進一步檢查6株M83T突變類型的菌株，當(dāng)靶位基因發(fā)生雙位點突變時，導(dǎo)致該菌株對環(huán)丙沙星高水平耐藥。T18P類型的突變株中，2株GyrA和ParC均未發(fā)生突變，對環(huán)丙沙星敏感性下降。而RamR發(fā)生氨基酸缺失的菌株，其靶位都發(fā)生雙位點突變，對環(huán)丙沙星高水平耐藥。從我們的研究結(jié)果可以看出，細菌獲得對環(huán)丙沙星的耐藥性，主要以雙靶位基因突變?yōu)橹鳎蝗欢煌瑀amR突變類型可能與靶位基因突變有協(xié)同作用。如M83T突變類型，當(dāng)gyrA只發(fā)生單位點突變時菌株對環(huán)丙沙星僅表現(xiàn)敏感性降低，而當(dāng)存在雙靶位突變時，ramR發(fā)生M83T突變，使得菌株對環(huán)丙沙星高水平耐藥。孫亞偉分析了實驗室誘導(dǎo)的靶位基因首次突變的誘導(dǎo)株其ramA表達的情況，結(jié)果顯示ramA表達增高能促進靶位基因的突變，使細菌獲得高水平耐藥。因此細菌獲得環(huán)丙沙星的耐藥性應(yīng)該是兩種機制協(xié)同作用的結(jié)果。

表1 各菌株耐藥分子表型特征及靶位基因和ramR基因的突變情況

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