天山雪蓮藥材與雪蓮注射液指紋圖譜相關性研究

劉 婧，許麗佳，何正有，李 維，鄒 昆，姚 潔

(1.成都大學 四川抗菌素工業研究所，四川 成都 610052;2.成都大學 外國語學院，四川 成都 610106)

0 引 言

天山雪蓮是菊科植物天山雪蓮的干燥地上部分，具有補腎活血、強筋骨等功效［1］.雪蓮注射液是由天山雪蓮經提取、精制而成的注射液，具有消炎鎮痛、消腫、活血化瘀等功效，臨床上用于治療急、慢性風濕性關節炎，類風濕性關節炎及骨關節炎引起的關節疼痛等癥［2］.相關研究表明，中藥指紋圖譜能整體、特征與穩定地控制中藥及其制劑質量［3－5］.本研究根據《中藥注射劑指紋圖譜的技術要求(暫行)》，對天山雪蓮及雪蓮注射液的指紋圖譜進行研究，并通過指紋圖譜各共有峰對兩者的相關性進行研究，擬為提高雪蓮注射液的工藝與質量控制水平提供參考.

1 儀器與材料

1.1 儀 器

實驗所用儀器包括:Agilent 1200 型高效液相色譜儀(配有紫外檢測器、自動進樣器、四元梯度泵、在線脫氣裝置、Agilent Chem Station 色譜工作站，美國Agilent 公司);Ultimate XB-C18色譜柱(250 ×4.6 mm，5 μm，美國Welch 公司);AE240 型分析天平(瑞士METTLER 公司).

1.2 試 藥

實驗所用試藥包括:甲醇，色譜純，由國藥集團化學試劑有限公司生產;水為超純水，其他試劑均為分析純;紫丁香苷(批號，111574－200603)、綠原酸(批號，110753－ 200413)、蘆丁(批號，100080－200707)對照品，均購于中國藥品生物制品檢定所.

1.3 樣 品

實驗所用樣品包括:天山雪蓮(新疆和靜)，由國藥集團新疆制藥有限公司提供，經成都中醫藥大學胡慧玲老師鑒定為菊科植物天山雪蓮的干燥地上部分，符合《中國藥典》2010年版一部有關各項的規定，共10 批.雪蓮注射液共11 批，由國藥集團新疆制藥有限公司提供.

2 方法與結果

2.1 指紋圖譜色譜條件

實驗的色譜條件為:色譜柱為Ultimate XB-C18(4.6 ×250 mm，5 μm).以0.06%醋酸水為流動相A，以0.14%醋酸甲醇為流動相B.梯度洗脫，0 ～18 min，B(5%)，流速(0.5 mL·min－1);18 ～45 min，B(5% ～22%)，流速(0.5mL·min－1);45 ～55 min，B(22%)，流速(1.0 mL·min－1);55 ～95 min，B(22% ～60%)，流速(1.0mL·min－1);95 ～100 min，B(60%)，流速(1.0 mL·min－1);柱溫為25℃，檢測波長為260 nm，進樣量為5 μL;理論板數按綠原酸峰計算應不低于8 000.

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備.

精密稱取紫丁香苷、綠原酸、蘆丁對照品適量，120 ℃干燥至恒重，加甲醇制成每1 mL 中分別含紫丁香苷、綠原酸、蘆丁0.118、0.108、0.2092 mg 的對照品溶液.

2.2.2 天山雪蓮供試品的制備.

取雪蓮粉末4 g，過三號篩，加100 mL 水，稱重，超聲提取30 min，室溫放置，用水補重，用0.45 μm微孔濾膜過濾，制得供試品溶液.

2.2.3 雪蓮注射液供試品的制備.

取本品用0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續濾液，制得注射液供試品溶液.

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗.

取天山雪蓮供試品溶液和雪蓮注射液供試品溶液各1 份，連續進樣6 次，檢測其指紋圖譜，以紫丁香苷峰為參照峰，計算主要共有峰的相對保留時間及相對峰面積.結果顯示，其相對保留時間的RSD均＜0.571%，相對峰面積的RSD 均＜1.644%，表明本方法精密度良好.

2.3.2 穩定性試驗.

取天山雪蓮供試品溶液和雪蓮注射液供試品溶液各1 份，分別于0、4、8、12、24、36 h 檢測指紋圖譜，以紫丁香苷峰為參照峰，計算主要共有峰的相對保留時間及相對峰面積.結果顯示，其相對保留時間的RSD 均小于1.493%，相對峰面積的RSD 均小于2.437%，表明本方法穩定性良好.

2.3.3 重復性試驗.

取天山雪蓮供試品溶液和雪蓮注射液供試品溶液各6 份，分別檢測其指紋圖譜，以紫丁香苷峰為參照峰，計算主要共有峰的相對保留時間及相對峰面積.結果顯示，其相對保留時間的RSD 均小于1.547%，相對峰面積的RSD 均小于2.669%，表明本方法重復性良好.

2.4 樣品測定

按照高效液相色譜法［1］分別精密吸取混合對照品溶液、天山雪蓮供試品溶液和雪蓮注射液供試品溶液5 μL，注入液相色譜儀，記錄100 min 色譜圖.

2.5 指紋圖譜共有模式的建立

分別將10 批天山雪蓮和11 批雪蓮注射液的指紋圖譜導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”軟件，采用中位數法生成天山雪蓮和雪蓮注射液的對照圖譜.指紋圖譜如圖1、2 所示，對照圖譜如圖3、4 所示.

圖1 天山雪蓮指紋圖譜

圖2 雪蓮注射液指紋圖譜

圖3 天山雪蓮對照圖譜

圖4 雪蓮注射液對照圖譜

2.6 相似度分析

分別將10 批天山雪蓮和11 批雪蓮注射液的指紋圖譜導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”軟件，對各樣品與其對照圖譜進行比較，其相似度結果見表1.

表1 天山雪蓮和雪蓮注射液各批樣品的相似度分析結果

2.7 天山雪蓮與雪蓮注射液相關性分析

在天山雪蓮對照圖譜中，第9 號峰為紫丁香苷峰，在雪蓮注射液對照圖譜中，第14 號峰紫丁香苷峰.因為紫丁香苷在天山雪蓮和雪蓮注射液中出峰時間及峰面積較穩定，所以選擇紫丁香苷為參比峰.以紫丁香苷的出峰時間為1，分別計算各共有峰的相對保留時間，結果見表2.

表2 天山雪蓮和雪蓮注射液各共有峰的相對保留時間

對天山雪蓮與雪蓮注射液各共有峰的相對保留時間對比分析可見，雪蓮注射液中的峰1、5、6、7、9、11、14、15、17 均來自天山雪蓮藥材.作為天山雪蓮含量測定成分的紫丁香苷、綠原酸和蘆丁分別是天山雪蓮對照圖譜中共有峰的第9、10 和12 號峰，雪蓮注射液對照圖譜中第14、15 和17 號峰，其中綠原酸和蘆丁的相對峰面積分別在天山雪蓮中的1.12和3.36，雪蓮注射液中的0.58 和0.67.

3 討 論

1)本研究色譜條件分別考察了色譜柱、流動相、柱溫和檢測波長，選擇圖譜基線較平穩、色譜峰數目較多且分離度較好的色譜條件:Ultimate XBC18(4.6 ×250 mm，5 μm)色譜柱，0.06%醋酸水—0.14%醋酸甲醇，梯度洗脫，柱溫25 ℃，檢測波長260 nm.

2)對10 批天山雪蓮樣品進行分析，其相似度在0.866 ～0.926 范圍，有兩批樣品(S1，S10)相似度小于0.90.由于天山雪蓮生長在海拔3 500 m 以上，生長環境極為復雜，自然生長周期達5 ～8年，并且人工栽培困難，所以天山雪蓮的化學成分有一定的差異［6－7］.

3)對11 批雪蓮注射液進行分析，指紋圖譜整體相似，各批次的色譜峰數和峰面積差異較小，其相似度大于0.90，可認為其相似度良好.實驗結果表明，雪蓮注射液制備工藝的穩定性良好，各批次樣品差異較小.

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典［M］.北京:中國醫藥科技出版社，2010.

［2］陳惠忠，劉宣麟，薛桂蓬.雪蓮注射液質量標準的研究［J］.新疆中醫藥，2006，24(5):76－78.

［3］顧英，馮怡，李玉敏.指紋圖譜在中藥物質基礎中的應用［J］.中成藥，2007，29(7):1048－1051.

［4］周建良，齊煉文，李萍.色譜指紋圖譜在中藥質量控制中的應用［J］.色譜，2008，26(2):153－159.

［5］屠鵬飛.高效液相色譜法制定中藥材和中藥注射劑特征指紋圖譜的探討［J］.中成藥，2000，22(7):516.

［6］陳玉珍，李鳳蘭.藥用資源植物雪蓮化學成分及藥理作用［J］.中國野生植物資源，2005，24(3):1－4.

［7］袁曉凡，趙兵，王玉春.雪蓮的研究進展［J］.中草藥，2004，35(12):1424－1426.

［8］國家藥典委員會.中藥注射劑指紋圖譜實驗研究技術指南(試行)［EB/OL］.［2002－04－27］.http://www.chp.org.cn.