煙草PGIP基因在枯草芽孢桿菌中的表達

江翱 吳輝 袁夢思 孫文秀

摘要：根據GenBank數據庫報道的林煙草（Nicotiana sylvestris）PGIP基因cDNA序列，設計特異性引物，從普通煙草（Nicotiana tabacum）種植品種小黃金中分離得到了其gDNA序列，分析結果發現煙草PGIP基因沒有內含子序列。信號肽分析結果表明，煙草PGIP基因含有一段長28個氨基酸的信號肽。將去除信號肽的煙草PGIP基因片段亞克隆至枯草芽孢桿菌表達載體pHT43中，轉化枯草芽孢桿菌菌株WB600并進行IPTG誘導。SDS-PAGE電泳表明，重組菌株可成功表達目的蛋白質，分子質量符合預期大小；瓊脂擴散試驗結果發現，表達的煙草PGIP蛋白質能夠明顯抑制辣椒疫霉PGs的活性。

關鍵詞：煙草（Nicotiana tabacum）；多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白質（PGIPs）基因；枯草芽孢桿菌；表達

中圖分類號：Q786 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）11-2767-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.11.055

Recombinant Expression of Tobacco PGIP Gene in Bacillus subtilis

JIANG Ao， WU Hui， YUAN Meng-si， SUN Wen-xiu

（College of Life Sciences， Yangtze University， Jingzhou 434025， Hubei， China）

Abstract： The Nicotiana tabacum PGIP gDNA from the cultivar “xiaohuangjin” was cloned basing on one PGIP gene from the Nicotiana sylvestris. Sequence analysis showed that the gDNA of tobacco PGIP was identied to the cDNA sequence， with no introns. The tobacco PGIP gene was submitted to a online program for searching the signal peptide sequence. The results showed that the tobacco PGIP gene had a 28 amino acids signal sequence. Subsequently， the mature peptide sequence was subcloned into pHT43 expression vector and transferred into Bacillus subtilis WB600. After induced using IPTG， SDS-PAGE analysis showed that the recombinant protein expressed successfully with the expected molecular weight. Then the activity of the recombinant protein was determined by using AGAR double diffusion experiments. The results indicated that the recombinant PGIP of tobacco could inhibit the activity of PGs from Phytophthora capsici obviously.

Key words：tobacco（Nicotiana tabacum）；polygalacturonase-inhibiting proteins（PGIPs）gene；Bacillus subtilis；recombinant expression

植物細胞壁是對抗真菌入侵的第一道物理屏障。在真菌侵染植物的早期，病原菌通過分泌一系列內源性多聚半乳糖醛酸酶（Endo-PGs）來降解細胞壁組分給其他水解酶降解細胞組織提供便利條件，從而使其很容易在植物細胞中定殖并獲取營養[1]，因此，Endo-PGs被認為是植物病原的重要致病因子[2]。多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白質（PGIPs）是由植物細胞壁產生的用來降解Endo-PGs的一類糖蛋白質，它們會通過抑制PGs的活性，促進細胞內鏈寡聚半乳糖醛酸（OGs）的積累，從而激活植物天然免疫系統[3]。單子葉植物和雙子葉植物細胞壁中都廣泛存在有PGIPs，它們只對病原物產生的PGs起作用，而對植物本身和病原物產生的其他果膠酶無效[2]。不同植物的PGIPs具有相似的結構和序列特征，但與不同病原真菌PGs特異識別的能力卻存在很大差異[4]。這就提示，十分有必要開展PGIPs新成員分離和鑒定的研究。目前國內外已報道了大豆[5]、梨[6]、蘋果[7，8]、棉花[9]、桃[10]、大白菜[11]、草莓[12]、油菜[13]、甜瓜[14]、水茄[15]和辣椒[16]等多種經濟作物的PGIP基因分離和功能的研究。目前尚未見普通煙草（Nicotiana tabacum）種植品種PGIP基因的克隆及功能研究的報道。

研究表明PGIP在植物抗真菌病害的實踐中具有重要作用。不僅分離到的植物PGIP蛋白質在體外表現出較高的抑制病原PGs的活性[17]，轉PGIP基因的植物也表現出較強的抗真菌病害的能力。轉獼猴桃PGIP基因的蘋果樹對病原真菌的抗性明顯增強[18]。轉梨PGIP基因的馬鈴薯（Solanum tuberosum）對灰霉菌（Botrytis cinerea）的感染力明顯下降[19]。而多數擬南芥屬植物導入了擬南芥（Arabidopsis thaliana）Atpgip1和Atpgip2基因以后，對灰霉菌的抗性明顯增強[20]。這些研究都充分說明PGIP基因在植物抗病分子育種的應用前景非常廣闊。

枯草芽孢桿菌在工業發酵和微生物分子遺傳學領域具有重要研究價值[21]。由于其具有遺傳背景清楚、不分泌內毒素、生物安全性高等優點，枯草芽孢桿菌表達系統也被用作外源基因表達的優良宿主[22]。在植物病害生物防治領域枯草芽孢桿菌菌株具有廣泛的應用前景[23]。

該研究中，筆者根據林煙草（Nicotiana sylvestris）PGIP基因設計特異性引物從普通煙草小黃金中克隆得到了PGIP基因的序列，分析了其基因組DNA結構，預測了其信號肽序列并構建了枯草芽孢桿菌表達系統，實現了在WB600菌株中的表達，分析了表達蛋白質對來自于辣椒疫霉PGs的抑制作用。為進一步研究煙草PGIP基因的功能及開發具有廣譜抗真菌的生防菌株奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料為普通煙草種植品種小黃金嫩葉，液氮速凍后于-80 ℃冰箱保存。

大腸桿菌菌株DH5α感受態細胞、DNA凝膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒、Trans-DNA marker 2 kb plus、T4 DNA連接酶、pEASY-T1克隆載體為北京全式金公司產品；pHT43枯草芽孢桿菌表達載體及枯草芽孢桿菌菌株WB600為杭州寶賽生物技術有限公司產品；限制性內切酶XbaⅠ和SmaⅠ為NEB公司產品；Trizol試劑為Invitrogen公司產品；反轉錄試劑盒采用Takara公司的PrimeScriptRT reagent kit with gDNA eraser；蛋白質Marker為北京博邁德生物技術有限公司產品；其他生化試劑均為國產分析純試劑。

1.2 基因組DNA、總RNA提取及DNA片段的擴增

基因組DNA提取采用CTAB法進行。總RNA的提取采用Trizol試劑盒說明書進行；cDNA第一條鏈的合成按照PrimeScriptRT reagent kit試劑盒說明書進行。根據林煙草的PGIP基因設計特異性引物用來擴增克隆至pEASY-T1克隆載體的基因片段。設計的上游引物Tpig17F序列為：5′-ATGCTTCATAAAATGAAAACCTC-3′和下游引物Tpig17R序列為：5′-TCACGATTTACAAGGTGGCAA-3′。分別以煙草gDNA和反轉錄合成的cDNA第一鏈為模板進行PCR，程序為：94 ℃預變性4 min； 94 ℃變性30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，35個循環；72 ℃延伸7 min。

擴增后的DNA經過凝膠回收純化后，連接至pEASY-T1載體，挑選3個陽性克隆送上海博尚生物科技有限公司進行序列測定。

1.3 煙草PGIP基因的序列分析及進化樹構建

從GenBank下載不同物種的PGIP基因序列，采用DNAMAN軟件進行多序列比對；用MEGA 5.0的最大似然法進行遺傳進化樹構建；用SignalP 4.1 （http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）進行信號肽序列預測；利用Predictprotein在線網站（https：//www.predictprotein.org/）對推斷的氨基酸序列二級結構進行預測。

1.4 煙草PGIP基因成熟肽序列擴增及枯草芽孢桿菌重組表達載體的構建

根據上述“1.2”獲得的煙草PGIP基因序列，設計1對用來擴增PGIP基因成熟肽片段的引物se17，其上游引物se17F序列為：5′-CGCTCTAGAGAAAGATGCAATCCAAATGA-3′，下游引物se17R引物序列為：5′-TACCCCGGGTCACGATTTACAAGGTGGCAG-3′。其中上游引物根據需要添加了Xba Ⅰ酶切位點，下游引物添加了Sma Ⅰ酶切位點（引物序列中下劃線所示）。PCR擴增程序如下：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，61 ℃ 30 s，72 ℃ 75 s，35個循環；72 ℃延伸7 min。PCR產物經回收純化后克隆至pEASY-T1，挑選3個陽性克隆送上海博尚生物科技有限公司進行序列測定，測序正確的質粒命名為p-TR1。

將該質粒大量制備后和pHT43質粒同時進行雙酶切，回收目的基因小片段和質粒大片段。將目的片段進行T4連接酶連接后再轉化DH5α，經過50 μg/mL氨芐培養基篩選和菌落PCR鑒定為陽性的菌株送公司測序，序列測定正確的質粒命名為pHT-TR1。

1.5 枯草芽孢桿菌感受態細胞制備及質粒轉化

按照李瑞芳等[24]的方法制備枯草芽孢桿菌感受態細胞及進行質粒的轉化。挑取單一WB600單菌落接種于2.5 mL 培養基GM1中（1.00 mL 10 × Spizizen salts， 0.10 mL 10%酵母粉， 0.25 mL 20% 葡萄糖， 0.20 mL 1%水解酪蛋白質， 補充滅菌蒸餾水至總體積10 mL），30 ℃ 150 r/min振蕩培養過夜后，按照10%的接菌量接種于新鮮配制的5 mL GM2（1.00 mL 10 × Spizizen salts， 0.05 mL 10%酵母粉， 0.25 mL 20%葡萄糖，0.04 mL 1%水解酪蛋白質， 0.05 mL 0.1 mol/L CaCl2， 1.00 mL 25 mmol/L MgCl2， 補充滅菌蒸餾水至總體積10 mL）中進行傳代，30 ℃ 250 r/min振蕩培養90 min后取1 mL培養液在5 000 r/min室溫離心10 min，用200 μL新鮮的GM2溶液重選菌液，即為感受態細胞。取適量質粒加入新制備的感受態細胞中使終濃度為1 μg/mL，混勻后30 ℃水浴60 min后，30 ℃ 200 r/min振蕩培養3 h，涂布在含有氯霉素（10 μg/mL）的LB固體平板上，30 ℃過夜培養至單克隆出現。

1.6 SDS-PAGE對重組蛋白質表達的檢測

挑取上述單克隆在含有氯霉素（10 μg/mL）液體LB培養基中進行培養，培養至OD600為1.0時加入終濃度為1.0 mmol/L IPTG進行誘導，誘導6 h后補加氯霉素使其終濃度為10 μg/mL，誘導至16 h后取1 mL菌液進行10 000 r/min離心收集，加入適量5×上樣buffer后進行12%的SDS-PAGE電泳。以沒有添加IPTG進行誘導的菌株作為對照。

1.7 PGIP粗蛋白質對辣椒疫霉PGs的抑制作用

辣椒疫霉菌PGs誘導方法參考Wang等[16]報道的方法進行。將辣椒疫霉菌接種于燕麥培養基上，28 ℃培養7 d。從菌落邊緣打10 mm菌絲塊，放入盛有100 mL Czapek培養基（0.2% NaNO3，0.1% K2HPO4， 0.05% MgSO4·7H2O，0.05% KCl，0.001% FeSO4）的250 mL三角瓶中（每個菌絲塊10 mL培養基）。培養3～5 d，培養物在4 ℃下，以12 000 r/min離心30 min，然后用Whatman GF/A 過濾，用0.1 mol/L pH 5.0乙酸鈉透析濃縮即為粗PGs。采用瓊脂擴散法測定重組蛋白質對辣椒疫霉PGs的抑制活性。首先倒瓊脂板，用0.05 mol/L pH 5.0醋酸緩沖液溶解0.5%多聚半乳糖醛酸和0.8%瓊脂糖，每個板打6個0.4 cm圓孔，每孔加入20 μL辣椒疫霉菌PGs濃縮液后，分別加入10、20、30、40 μL粗蛋白質及適量體積的Tris-HCl（pH 8.0），使其最終體積為60 μL，陰性對照采用加入40 μL WB600菌株發酵液，陽性對照加入40 μL經100 ℃煮沸10 min滅活的粗蛋白質。30 ℃孵育12 h 后，用0.1%釕紅溶液靜置染色1 h左右，倒去表面殘留的染色液，再用去離子水沖洗，觀察透明圈的大小。根據透明圈的大小確定重組蛋白質對辣椒疫霉菌PGs的抑制程度。

2 結果與分析

2.1 煙草PGIP基因的獲得及序列分析

利用基因特異性引物Tpig17F和Tpig17R分別從小黃金煙草葉片的cDNA和gDNA中各擴增得到了一條約1 000 bp的片段（圖1），將擴增產物回收克隆、測序后得到了煙草PGIP基因的序列。序列比對發現從gDNA中得到的序列和cDNA得到的序列只有個別堿基的不同，從而可確認該PGIP基因不含有內含子序列。

由圖2可知，該煙草PGIP基因全長1 017 bp，編碼一個長338 個氨基酸的多肽。將獲得的序列申請GenBank數據庫注冊序列號為KF500525。利用SignalP 4.2對推斷的煙草PGIP基因進行了信號肽預測，煙草PGIP基因信號肽序列長28個氨基酸，信號肽切割位點位于S28和E29之間。利用Predictprotein在線網站對推斷的氨基酸序列二級結構進行預測。結果表明，推斷的煙草PGIP基因包含有4個N-糖基化位點和10個重復的LRR保守序列，其中之一為典型的24個氨基酸長的富含亮氨酸重復序列（LSQLSNLEFLGLDRNKLTGPIPES）。進一步分析發現煙草PGIP基因所編碼氨基酸富含亮氨酸殘基在開放閱讀框里共編碼49個亮氨酸，占所有編碼氨基酸的14.5%。

2.2 序列比對及進化樹構建

利用DNAMAN軟件將煙草（Nicotiana tabacum，Nt）PGIP基因和來源于蘋果（Malus domestica，Md）、櫻桃（Prunus mahaleb，Pm）、馬鈴薯（Solanum tuberosum，St）、海島棉（Gossypium barbadense，Gb）、辣椒（Capsicum annuum，Ca）和巨桉（Eucalyptus grandis，Eg）的PGIP基因進行多序列比對發現，煙草PGIP基因和其他物種報道的PGIP基因具有相似的保守序列和功能區域；同源性分析發現煙草PGIP基因和辣椒的PGIP基因同源相似性達到了79.9%（圖3）。用MEGA 5.0軟件最大似然法構建的遺傳進化樹表明，煙草PGIP基因和辣椒PGIP基因具有最近的親緣關系，如圖4所示。

2.3 SDS-PAGE對煙草PGIP在WB600中表達的分析

陽性克隆經過1 mmol/L IPTG小量誘導后取1 mL發酵液進行離心收集蛋白質和菌體，加入上樣緩沖溶液后煮沸進行電泳，結果如圖5所示。由圖5可知，重組菌株經過誘導后在35 ku處出現一條蛋白質條帶，而陰性對照沒有出現該蛋白質條帶。據此可知，重組菌株已成功表達目的基因。

2.4 PGIP粗蛋白質對辣椒疫霉PG的抑制作用

由圖6可知，陰性對照（圖6a）和陽性對照（圖6b）可形成較大水解透明圈，加入PGIP粗蛋白質對來源于辣椒疫霉的PGs具有明顯的抑制作用；當加入較少粗蛋白質時，水解透明圈明顯變小（圖6c、圖6d）；隨著粗蛋白質濃度的增加，抑制效果也增強，水解透明圈已經非常小（圖6e、圖6f）；充分說明煙草PGIP基因已經成功在枯草芽孢桿菌中獲得了表達。

3 討論

PGIP及其類似分子作用多樣化，它們很可能參與了花器官發育[25]、花粉形成[26]和抗逆性[27]等過程。同樣地，在植物防御反應中PGIP分子具有重要作用，也可作為抗病分子育種的重要候選基因。

有研究發現，植物抗性基因的表達產物一般都含有LRR保守區域[28]。LRR結構由β-折疊/β-轉角/β-折疊/α-螺旋結構區域構成，被認為是參與蛋白質與蛋白質相互作用的關鍵區域[29]，而植物正是通過這些LRR區域識別外源病原分子，從而激活防衛反應[30]。現有的研究證實，高等植物PGIP超家族均具有典型的富含亮氨酸重復序列（LRR）[31]。典型的植物PGIP基因一般包括一個信號肽和幾個潛在的糖基化位點，并含有10個重復的LRR保守序列，其共有氨基酸序列為LXXLXLXXNXLXGXIPXXLAXLXXLRR，長度一般為20～29個氨基酸，其中核心保守序列為LXXLXLXXNXL[32]。筆者的研究發現，普通煙草的PGIP基因同其他植物上報道的PGIP基因一樣也具有10個LRR重復序列，其中一個是典型的LXXLXLXXNXLXGXIPXXLAXLXXLRR區域。這與在水茄[15]、棉花[9]和桃[10]等PGIP基因上的研究是一致的。另外，序列分析發現煙草PGIP基因富含亮氨酸殘基，在開放閱讀框里共編碼49個亮氨酸，占所有編碼氨基酸的14.5%。類似的結果也在其他物種的PGIP基因被發現，桃的PGIP基因亮氨酸比例高達16.06%（53/330），其中49個是植物中非常保守的[10]；而油菜中亮氨酸有50個，占氨基酸殘基總數的14.88%[13]。序列分析發現，煙草PGIP基因只有4個N-糖基化位點，少于油菜的5個[13]，水茄的9個[15]，大白菜的6個[11]和桃的7個[10]。N-糖基化位點的數目對煙草PGIP活性的影響需要進一步去深入研究。

目前已有少量植物的PGIP基因已經實現了在大腸桿菌的高效表達。劉睿洋等[13]將湘油15的PGIP9基因亞克隆至pET32a表達系統，實現了在大腸桿菌的融合表達，但表達的融合蛋白質以包涵體形式存在。熊帥等[33]將富士蘋果的PGIP基因亞克隆至pET32a表達系統，同樣發現表達產物以包涵體的形式存在。這些報道發現采用pET32a表達系統表達的重組PGIP蛋白質均比預期蛋白質大的多，且均為不溶性的包涵體占多數，這在一定程度上影響了蛋白質功能的研究。王秀菊[34]的研究發現，將辣椒的3種PGIP基因重組至pET28a表達系統后，表達的重組蛋白質分子質量均與預期相符，可溶性蛋白質的比例較高，而且表達的重組蛋白質對辣椒疫霉等11種真菌或卵菌產生的PGs有較好的抑制作用。除了大腸桿菌表達系統以外，酵母表達系統也是一種有效的表達PGIP蛋白質的途徑。燕孟郊[35]發現利用畢赤酵母表達系統表達的油菜PGIP基因具備一定的抑制黑脛病病原NM-1分泌的PGs的作用。目前，很少有關于PGIP基因在枯草芽孢桿菌中表達的相關報道。作者的研究證實，煙草的PGIP基因可以實現在枯草芽孢桿菌菌株WB600中分泌表達，表達的產物具有較好的抑制真菌PGs的活性。這為進一步實現PGIP基因在枯草芽孢桿菌生防菌株中的表達提供了參考資料，也為進一步研究PGIP基因的功能積累了實踐經驗。

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