安絲菌素P—3的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

谷政偉 朱曉媛 黎繼烈

摘要：為了優(yōu)化安絲菌素P-3（AP-3）的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基，以AP-3產(chǎn)量為主要指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)U*15（157）對培養(yǎng)基中碳源、氮源和前體異丁醇進(jìn)行優(yōu)化。得到最適培養(yǎng)基配方為葡萄糖4.22%，麥芽糖0.75%，玉米漿3.42%，乙酸銨0.41%，異丁醇0.43%，碳酸鈣0.50%，氫氧化鈉0.12%，磷酸氫二鉀0.10%，pH（7.4±0.2）。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，AP-3產(chǎn)量為（51.86±1.33） mg/L，與模型預(yù)測值接近。表明該優(yōu)化方法切實(shí)可行，能夠獲得較高的AP-3產(chǎn)量。

關(guān)鍵詞：安絲菌素P-3；發(fā)酵；培養(yǎng)基；優(yōu)化

中圖分類號：TQ920.6 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）11-2707-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.11.039

Optimization of Shaking-flask Fermentation Medium for Ansamitocin P-3

GU Zheng-wei，ZHU Xiao-yuan，LI Ji-lie

（Central South University of Forestry and Technology/2011 Cooperative Innovation Center of Cultivation and Utilization for Non-Wood Forest Trees of Hunan Province/Key Laboratory of Cultivation and Protection for Non-wood Forest Trees，Ministry of Education，Changsha 410004，China）

Abstract： In order to optimize the shaking-flask fermentation medium for ansamitocin P-3（AP-3），the yield of AP-3 was used as major index， based on the single experiment， carbon sources， nitrogen sources and precursor isobutanol were optimized by the design method of even experiment U*15（157）.The optimum medium formulas were glucose 4.22%，maltose 0.75%，corn steep liquor 3.42%，ammonium acetate 0.41%，precursor isobutanol 0.43%，CaCO3 0.50%，NaOH 0.12%，K2HPO3 0.10%，pH （7.4±0.2）.Under the above condition， the yield of AP-3 was up to（51.86±1.33） mg/L， closely to the prediction of the model. Relatively high yield of AP-3 was gained by this feasible optimization.

Key words： ansamitocin P-3； fermentation； medium； optimization

安絲菌素（Ansamitocins）是一類由橙色珍貴束絲放線菌（Actinosynnema pretiosum）發(fā)酵生成的美登素類抗生素[1]，具有抗腫瘤、抗細(xì)菌、抗結(jié)核桿菌等生理活性[2，3]，其衍生物可以作為“彈頭”與單抗結(jié)合形成活性高、副作用小的抗體-藥物偶聯(lián)物（Antibody-drug conjugates，ADCs）[4-7]。根據(jù)C-3側(cè)鏈的碳鏈長度不同，安絲菌素可分為P-1、P-2、P-3、P-3和P-4五個(gè)組成部分，其中安絲菌素P-3是主要發(fā)酵產(chǎn)物[8，9]。

培養(yǎng)基組成是發(fā)酵過程必須考慮的因素，碳源對微生物生長代謝的作用主要是提供細(xì)胞及合成產(chǎn)物的碳架，提供細(xì)胞生命活動所需的能量。氮源主要用于合成氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸等菌體細(xì)胞物質(zhì)和含氮代謝物，包含有機(jī)氮源和無機(jī)氮源，兩者通常在發(fā)酵過程中混合使用。前體是次級代謝物生物合成的主要限制因素，往往決定抗生素的產(chǎn)量與質(zhì)量，主要來源于脂肪酸、單糖、蛋白質(zhì)等含碳物質(zhì)的代謝，還有些源于主代謝中無作用酶的催化產(chǎn)物。

本研究利用單因素試驗(yàn)考察培養(yǎng)基中不同碳源、氮源對安絲菌素P-3（AP-3）產(chǎn)量的影響，展開均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)U*15（157）對碳源、氮源和前體異丁醇的濃度進(jìn)行優(yōu)化，以期為AP-3和橙色珍貴束絲放線菌的進(jìn)一步開發(fā)與研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料：橙色珍貴束絲放線菌（Actinosynnema pretiosum spp. auranticum，APSP-01），由中南林業(yè)科技大學(xué)發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室提供。

主要試劑：AP-3標(biāo)準(zhǔn)品（HPLC）、玉米漿為美國Sigma公司產(chǎn)品；無水甲醇（HPLC）、甘油為分析純，為天津市富宇精細(xì)化工有限公司產(chǎn)品；酵母浸粉為英國OXOID公司產(chǎn)品；麥芽糊精為上海楷洋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品：麥芽浸粉、蛋白胨（分析純）為北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品；可溶性淀粉、蔗糖、無水葡萄糖、氫氧化鈉、磷酸氫二鉀、95%乙醇、麥芽糖、碳酸鈣、異丁醇、瓊脂均為國產(chǎn)分析純。

主要儀器：P680型高效液相色譜儀（美國戴安公司）；CJ-ID型水平超凈工作臺（天津市泰斯特儀器有限公司）；ZWY-2102C立式全溫振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司）；LDZH-100KBS立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基 ①單菌落分離平板培養(yǎng)基。甘油1.0%，蛋白胨0.5%，酵母浸粉0.3%，麥芽浸粉0.3%，瓊脂2.0%，pH（6.8±0.2），121 ℃滅菌20 min。②種子培養(yǎng)基。甘油1.0%，蛋白胨0.5%，酵母浸粉0.3%，麥芽浸粉0.3%，pH （6.8±0.2），121 ℃滅菌20 min。③初始搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基。麥芽糊精5.0%，大豆粉3.0%，碳酸鈣0.50%，氫氧化鈉0.12%，磷酸氫二鉀0.10%，異丁醇0.30%，pH （7.4±0.2）。

1.2.2 培養(yǎng)條件 ①單菌落分離平板培養(yǎng)。將甘油管保藏菌稀釋涂布到單菌落分離平板上，于28 ℃的生化培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)72～144 h。②種子培養(yǎng)。從單菌落分離平板上挖出單菌落，加2 mL無菌水，再加10 個(gè)玻璃珠，振蕩均勻，制成菌懸液，然后將其接種于種子培養(yǎng)基上（裝液量為30 mL/150 mL三角瓶或50 mL/250 mL三角瓶），于全溫振蕩器中以轉(zhuǎn)速200 r/min、28 ℃條件下培養(yǎng)72 h。③發(fā)酵培養(yǎng)。250 mL三角瓶裝發(fā)酵培養(yǎng)基50 mL，將種子液以5%接種量接入培養(yǎng)基中，于立式全溫振蕩器中以轉(zhuǎn)速200 r/min、28 ℃條件下培養(yǎng)168 h。

1.2.3 安絲菌素P-3的檢測

1）色譜條件。色譜柱為Hyperclone C18柱（250 mm×4.60 mm×5 μm）；流動相為乙腈-水（V/V=70/30）；流速為1.0 mL/min；檢測波長為252 nm；柱溫為25 ℃；進(jìn)樣量20 μL。AP-3標(biāo)準(zhǔn)品（純度98%）的HPLC圖譜如圖1所示，所得AP-3標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積為46.264。

2）標(biāo)準(zhǔn)曲線制作。取AP-3標(biāo)準(zhǔn)品用50%乙醇進(jìn)行稀釋分別得到質(zhì)量濃度為24.035、32.047、48.070、64.093、96.140 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。在“1.2.3”中“1）”的色譜條件下平行測定3次，然后以濃度x（mg/mL）為橫坐標(biāo)，平均峰面積y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程y=0.493 1x-0.890 8，相關(guān)系數(shù)r=0.998 9。

3）發(fā)酵培養(yǎng)液中AP-3的測定。取5 mL發(fā)酵液于試管中，加入95%乙醇至10 mL，混合均勻，振蕩10 min 后以 8 000 r/min離心5 min除去菌絲體，然后取上清液用0.45 μm微孔濾膜過濾后進(jìn)行HPLC測定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算AP-3含量。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用單因素試驗(yàn)和均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)。利用單因素試驗(yàn)考察了不同碳源、有機(jī)氮源和無機(jī)氮源對AP-3產(chǎn)量的影響，并根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)考察了發(fā)酵培養(yǎng)基組分葡萄糖、麥芽糖、玉米漿、乙酸銨、異丁醇5種因子對AP-3產(chǎn)量的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 不同碳源對AP-3產(chǎn)量的影響 分別用5.0%葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、淀粉、甘油替代初始搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中的麥芽糊精，其他成分不變，按“1.2”中方法進(jìn)行試驗(yàn)，探討不同碳源對AP-3產(chǎn)量的影響，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，當(dāng)碳源為甘油時(shí)，AP-3產(chǎn)量最低，當(dāng)碳源為葡萄糖時(shí)，AP-3產(chǎn)量最高。這是因?yàn)槠咸烟鞘且环N速效碳源，是菌體最好的生長碳源；麥芽糖作為碳源時(shí)，AP-3產(chǎn)量也較高，這是因?yàn)樘荚凑{(diào)控可能與次級代謝酶的直接抑制有關(guān)，適宜的培養(yǎng)基中一般包含適量的速效碳源和遲效碳源，速效碳源可被菌體快速利用，是菌體最好的生長碳源，但可能影響次級代謝物的形成，遲效碳源通常是發(fā)酵生產(chǎn)次級代謝物的最好碳源，可以與速效碳源一起加入。因此，選取葡萄糖、麥芽糖作為組合碳源進(jìn)行均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

2.1.2 不同有機(jī)氮源對AP-3產(chǎn)量的影響 分別用3.0%蛋白胨、牛肉膏、酵母浸粉、玉米漿、麥芽浸粉替代初始搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中的大豆粉，其他成分不變，按“1.2”中方法進(jìn)行試驗(yàn)，探討不同有機(jī)氮源對AP-3產(chǎn)量的影響，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，有機(jī)氮源為玉米漿時(shí)，AP-3產(chǎn)量最高，使用蛋白胨、牛肉膏和酵母浸粉為有機(jī)氮源時(shí)，AP-3產(chǎn)量偏低。這是因?yàn)橛袡C(jī)氮源是影響放線菌正常生長的重要因素，對次級代謝物的產(chǎn)量有重要作用，而玉米漿含有豐富的氨基酸、微量元素和生長素等物質(zhì)，可能有利于AP-3的產(chǎn)生。因此，選擇玉米漿為最佳有機(jī)氮源。

2.1.3 不同無機(jī)氮源對AP-3產(chǎn)量的影響 在“2.1.2”試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，再在初始搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入0.3%的硫酸銨、乙酸銨、氯化銨、硝酸銨、碳酸氫銨，其他成分不變，按“1.2”中方法進(jìn)行試驗(yàn)，探討不同無機(jī)氮源對AP-3產(chǎn)量的影響，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，乙酸銨可以提高AP-3產(chǎn)量，而其他銨鹽特別是硝酸銨明顯抑制AP-3產(chǎn)量，與專利報(bào)道一致[10]。可能原因是添加銨鹽等速效無機(jī)氮源可供前期菌體的快速生長，然而一定濃度的銨離子對許多次級代謝過程產(chǎn)生負(fù)作用，產(chǎn)生銨離子效應(yīng)，抑制AP-3產(chǎn)量。

2.2 均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)考察發(fā)酵培養(yǎng)基組分對AP-3產(chǎn)量的影響。選用U*15（157）均勻設(shè)計(jì)表，考察葡萄糖、麥芽糖、玉米漿、乙酸銨、異丁醇5種因子不同水平對珍貴橙色束絲放線菌APSP-01產(chǎn)AP-3的影響，每組試驗(yàn)重復(fù)2 次。U*15（157）均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

使用DPS 7.05軟件對表3的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式逐步回歸分析，得出AP-3產(chǎn)量與各因素關(guān)系的方程為：

y=-5.795-0.234x2-74.798x5+0.269x1x2+49.531x1x4+8.818x1x5+7.417x3x4-0.680x3x5+0.503x22+77.806x52

R2=0.989 9，模型P<0.01，回歸方程擬合極顯著，對所得的回歸擬合方程中的變量分別求一階偏導(dǎo)數(shù)，解方程的最優(yōu)結(jié)果為：葡萄糖4.22%，麥芽糖0.75%，玉米漿3.42%，乙酸銨0.41%，異丁醇0.43%，預(yù)測AP-3產(chǎn)量的最優(yōu)結(jié)果為53.87 mg/L。在最優(yōu)條件下進(jìn)行6次平行試驗(yàn)，AP-3實(shí)際產(chǎn)量為（51.86±1.33） mg/L，說明回歸模型真實(shí)可靠。

3 小結(jié)

目前安絲菌素生產(chǎn)水平低，市場價(jià)格昂貴。采用微生物發(fā)酵法制備安絲菌素具有周期短、費(fèi)用低、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，是解決上述問題的有效方法。本研究通過單因素試驗(yàn)確定培養(yǎng)基中最適碳源、氮源，展開均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)U*15（157）優(yōu)化培養(yǎng)基中兩種碳源（葡萄糖、麥芽糖），兩種氮源（玉米漿、乙酸銨）和前體異丁醇共5種成分的濃度。優(yōu)化搖瓶培養(yǎng)基的配方為葡萄糖4.22%，麥芽糖0.75%，玉米漿3.42%，乙酸銨0.41%，異丁醇0.43%，碳酸鈣0.50%，氫氧化鈉0.12%，磷酸氫二鉀0.10%，pH （7.4±0.2），在此條件下，AP-3產(chǎn)量為（51.86±1.33） mg/L，與模型預(yù)測值接近。表明該優(yōu)化方法切實(shí)可行，能夠獲得較高的AP-3產(chǎn)量。這對今后AP-3的進(jìn)一步研究及其發(fā)酵過程放大等工作的展開具有積極意義。

參考文獻(xiàn)：

[1] 林錦霞.橙色珍貴束絲放線菌發(fā)酵生產(chǎn)抗癌藥物安絲菌素P-3的研究[D].上海：華東理工大學(xué)，2011.

[2] 康前進(jìn).安絲菌素后修飾及安莎類抗生素聚酮鏈的釋放[D].上海：上海交通大學(xué)，2010.

[3] 姚駿驊，劉 明.HPLC-ESI/MS測定安絲菌素同系物[J].質(zhì)譜學(xué)報(bào)，2008，29（增刊）：108-109.

[4] 曹 剛，黃祚剛，程杰飛，等.抗體藥物偶聯(lián)物[J].化學(xué)進(jìn)展，2014，26（2/3）：467-477.

[5] ERICKSON H K，LAMBERT J M.ADME of antibody-maytansinoid conjugates[J].The APPS Journal，2012，14（4）：799-805.

[6] 石依冉，王 巖，陳少欣.抗體-藥物偶聯(lián)物的研究進(jìn)展[J].世界臨床藥物，2013，34（12）：755-759.

[7] WHITEMAN K R，JOHNSON H A，MAYO M F， et al. Lorvotuzumab mertansine，a CD56-targeting antibody-drug conjugate with potent antitumor activity against small cell lung cancer in human xenograft models[J]. mAbs， 2014，6（2）：556-566.

[8] 李婷蘭，韋柳靜，范宇翔，等.奇跡束絲放線菌合成安絲菌素過程中支鏈氨基酸的添加效果分析[J].華東理工大學(xué)學(xué)報(bào)，2013， 39（6）：675-680.

[9] 朱曉媛，黎繼烈，韋曉菊，等.基于遺傳算法的安絲菌素P-3分批發(fā)酵動力學(xué)研究[J].中國釀造，2013，32（12）：101-104.

[10] 丁靖志，倪穗佳，孟銳奇，等.生產(chǎn)安絲菌素的發(fā)酵培養(yǎng)基[P].中國專利：CN 103255184A，2013-08-21.