臨床生化綜合性實驗
——肥胖大鼠血糖血脂的檢測

李 姣,方小楠,胡安南,呂立夏,徐 磊,徐國彤

(同濟大學醫學院 生物化學與分子生物學教研室,上海 200092)

臨床生化綜合性實驗
——肥胖大鼠血糖血脂的檢測

李 姣,方小楠,胡安南,呂立夏,徐 磊,徐國彤

(同濟大學醫學院 生物化學與分子生物學教研室,上海 200092)

針對二年級的醫學生,結合與物質代謝相關的臨床疾病——肥胖及糖尿病,將原有臨床生化實驗重新調整,設計成一組綜合性實驗,通過構建營養型肥胖大鼠模型,使學生通過實驗觀察正常和肥胖大鼠血糖水平、血漿脂蛋白成分的變化，以及2組大鼠對胰島素的敏感性。結合理論課糖類和脂類代謝的內容,激發學生對于疾病的思考,更好地理解代謝異常所導致疾病的發病機制,為將來的臨床應用打下基礎。

臨床生化實驗;營養型肥胖;血糖;血脂;胰島素

血糖和血脂的檢測是臨床生化實驗的主要內容。這部分實驗主要涉及生物化學理論課糖類和脂類代謝的知識,臨床上常見的糖尿病、高脂血癥及相關的高血壓、動脈粥樣硬化都與這部分內容緊密相關。以往的實踐中,血糖和血脂的檢測是分別放在2個不同的實驗,血糖檢測中只觀察了胰島素的降血糖效應,血脂檢測中只進行了脂蛋白電泳,學生對于肥胖疾病模型的構建和相應代謝指標的變化并沒有整體和系統的了解。針對上述不足,將實驗重新調整,將其設計成相對完整的綜合性的臨床生化實驗。本實驗改革已在醫學本科生教學中連續應用2年。

1 實驗目的

在實驗中,學生首先觀察到部分進食高脂飲食的大鼠體重明顯大于正常飲食大鼠,并將大鼠分成對照組和肥胖組;接下來剪尾取血檢測2組大鼠的血糖和進行胰島素的敏感度實驗;同時將2組大鼠的血漿進行脂蛋白電泳觀察脂蛋白成分的變化;最后匯總數據進行分析討論。通過參與整個實驗,學生對肥胖及其相關的血糖和血脂代謝異常印象深刻,加深了對理論課內容的理解和記憶,同時激發了對于疾病發病機制的思考,為醫學生將來的臨床實踐和應用打下良好基礎。

目前的研究表明,肥胖與糖尿病、高脂血癥及相關的高血壓、動脈粥樣硬化等疾病的發病密切相關[1-2](見圖1),其發病機制主要是由于脂肪組織所產生的細胞因子所致。脂肪組織不僅是能量儲存器官,還是機體重要的內分泌器官,可產生多種激素和因子,如瘦素(leptin)、腫瘤壞死因子α(TNFα)、脂聯素、內脂素、抵抗素、白細胞介素-6等,統稱為脂肪細胞因子[3-5]。這些因子對機體的物質能量代謝及其調節有重要影響[6-7],肥胖時脂肪細胞因子表達發生變化,其中脂聯素是目前最明確和最重要的一個具有抗胰島素抵抗作用的脂肪細胞因子,參與糖、脂的代謝,體重增加時血清脂聯素水平明顯降低,而瘦素、腫瘤壞死因子α、白細胞介素-6等水平增高,結合其他相關因子的相互作用進而導致葡萄糖耐量異常、高脂血癥、糖尿病和視網膜病等一系列疾病的發生。

圖1 肥胖與很多疾病相關

糖類代謝和脂類代謝是醫學生生物化學物質代謝章節的主要內容,其代謝異常是導致臨床很多疾病的發病原因。為使學生更好地理解理論知識并聯系臨床應用,同時提高學生學習的興趣,將臨床生化檢測實驗設計成相對連續完整的從肥胖模型建立到血糖血脂檢測的綜合設計性實驗,使學生能夠觀察疾病的發生發展,在實踐中激發對疾病發病機制的思考。

2 實驗課程基本流程

本實驗內容是二年級醫學生“生命科學綜合實驗Ⅰ”課程中9個實驗當中的一個。本實驗一共6個學時,每班有16個學生,2個學生一組。成績由3部分組成:筆試 (30%)、實驗報告(50%)、操作表現和出勤(20%)。表1為實驗安排。

表1 臨床生化實驗安排

2.1 實踐 1: 大鼠稱重和喂養

成年雄性SD大鼠購于上海斯萊克實驗動物公司。每組2個學生操作1只大鼠,每班有12只大鼠,多出的大鼠留作備用(以備死亡或肥胖抵抗)。本實驗的目的是建立肥胖大鼠模型,進而檢測肥胖大鼠和對照大鼠的血糖、血脂和胰島素調節情況。

隨機將大鼠分成對照組和高脂飲食組,喂養4周。大鼠飼養在醫學院動物中心,由專門的技術人員每天照看。高脂飲食譜:正常飲食 60.7 %,豬油 12 %,蔗糖 8 %,全脂奶粉5 %,膽固醇2 %,蛋黃粉 10 %,膽鹽0.3 %,鹽2 %[8]。

4周喂養結束,每班學生對大鼠稱重。對照組和高脂組各選4只進行后繼實驗。高脂組中選取體重超過對照20%的大鼠。大鼠體重比較見表2。8只大鼠分別進行標記,并在實驗前一天禁食12 h。整個學生的實驗操作在實驗教學中心的學生實驗室進行。

表2 對照和高脂組大鼠體重比較

注: 1.體重:喂養4周后體重;2.*P<0.01 與對照組比較

2.2 實踐 2: 血糖檢測,胰島素耐量實驗,脂蛋白電泳

整個檢測可分成3部分。

第一部分:

教師首先對本次檢測的原理和操作做一詳細的闡述。本次授課最大的特色在于給學生演示胰島素注射和剪尾取血的視頻,本視頻由經驗豐富的教師擔任主角,以簡潔、輕松并帶幽默的方式示教,使艱苦的工作有個輕松的開始。

第二部分:

首先剪尾取血:將鼠尾在45 ℃溫水中浸泡數min,擦干鼠尾,將尾尖剪去5 mm(大鼠)。從尾根部向尾尖部按摩,血即從斷端流出,讓血液滴入試管。取血后,用棉球壓迫止血,保護傷口。接下來注射激素與后繼采血:皮下或腹腔內注射胰島素,0.75 IU/kg(60 U/kg),分別在30,60,90和120 min后取血0.2～0.3 mL,標明胰1-4。3 000 r/min離心5 min,分離血清。加入抗凝劑時,3 000 r/min離心5 min,分離血漿。

第三部分:

(1) 血糖測定。葡萄糖氧化酶法(GOD-POD法),見表3。將樣品置37 ℃水浴 10 min,用波長 505 nm,空白管調“零”點測定各管的吸光度(A)值。

(2) 預染血清(血漿)。各處理組血清0.2 mL中加入蘇丹黑B染色液0.02 ml,混勻后置42oC水浴30 min,離心(2 000 r/min)5 min。

(3) 電泳。預染血清樣品近負極端,接通電源,電壓100～120 V，電泳約45 min。學生記錄數據并拍照。

表3 血糖測定葡萄糖氧化酶法(GOD-POD法) μL

2.3 實踐 3: 數據分析和討論

學生制作PPT,顯示數據,進行分析討論。數據見表4和圖2。從上述2個主要的結果可以看到,肥胖組大鼠的空腹血糖與對照組相比有升高,而且對胰島素降血糖的敏感度也低于對照組;血漿脂蛋白電泳結果中,高脂組的低密度脂蛋白(LDL)含量與對照組相比增加。

表4 空腹血糖的比較

注:*P<0.01 與對照組比較。

圖2 胰島素耐量實驗

3 討論

建立疾病動物模型是研究疾病的常用方法。建立肥胖大鼠模型的技術比較成熟易操作,并且重復性也較好[9-12]。本實驗課程從造模到檢測再到數據分析討論,學生通過整個流程對疾病的研究方法和代謝變化有了一個基本的認識和體會。

在第一步中,學生首先對成年大鼠進行稱重,在教師的指導下,學生對大鼠的一些基本習性和抓取方法有一個簡單了解,并對大鼠的大小有一個直觀的認識,加深對大鼠生長,尤其是高脂飲食組體重增長明顯的直觀印象。通過觀察,學生在最后的討論中意識到飲食結構能夠明顯地影響體重。

在第二步中,教師制作的視頻簡短而輕松,學生都能夠認真觀看并印象頗深,接下來在教師的指導下通過激素注射和反復的剪尾取血,可以看到每小組2個學生的操作越來越熟練，并且合作也越來越默契,大大提高了學生的動手能力。通過離心觀察到與正常飲食大鼠血漿相比,有2只高脂飲食大鼠的血漿明顯變得渾濁,從而加深對高脂飲食影響體內代謝的直觀認識。

接下來通過對血糖血脂的檢測進一步認識到高脂飲食會導致血糖的升高和對胰島素降血糖調節的抵抗。

在第三步的討論中,學生已經對高脂飲食對機體造成的影響有了比較清晰的認識,并且聯系自身的生活習慣，提高了預防疾病的意識,同時教師聯系學生所學生化理論知識和臨床疾病,如Ⅱ型糖尿病和高脂血癥進行總結性講解,進一步加強了學生對所學生化基礎知識的臨床應用。

4 結束語

通過本實驗,學生提高了動手能力、增強了團隊意識,并且將所學的生化知識應用于生活和臨床。本實驗適合作為設計性臨床生化實驗推廣應用。

References)

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Integrated experiment-clinical biochemistry determination of obese rat’s blood glucose and lipoprotein

Li Jiao,Fang Xiaonan,Hu Annan,Lü Lixia,Xu Lei,Xu Guotong

(Department of Biochemistry and Molecular Biology,School of Medicine,Tongji University,Shanghai 200092,China)

For Grad 2 medical students,this paper puts forward to redesign the original experiment and develop a relatively integral clinical biochemistry experiment. During experimental period, the students observe obesity resulted from high fat diet,abnormal insulin tolerance and lipoprotein content change in obese rat. The students are not only exposed to techniques and equipment but also inspired to think more about disease. Associated with lecture topics about metabolism of carbohydrates and lipids,the students get a better understanding about relevance of carbohydrates and lipid metabolism to related disease. It can lay a profound foundation for medical student’s clinical application.

clinical biochemistry experiment;nutritional obesity;blood glucose;blood lipoprotein;insulin

2014- 05- 12 修改日期：2014- 07- 18

同濟大學實驗教學改革第6期項目“激素和飲食對大鼠糖類和脂類代謝的影響”

李姣(1977—),女,遼寧沈陽,博士,講師,生物化學與分子生物學專業

呂立夏(1969—),女,河南，博士,副教授,研究方向為干細胞分子生物學.

E-mail：li2sister@163.com

G642.423

A

1002-4956(2015)1- 0185- 03