微生物教學實驗中菌株革蘭氏染色反應快速判定

劉春爽,趙朝成,顧瑩瑩,張云波,劉 芳

(中國石油大學(華東) 化學工程學院,山東 青島 266580)

實驗技術與方法

微生物教學實驗中菌株革蘭氏染色反應快速判定

劉春爽,趙朝成,顧瑩瑩,張云波,劉 芳

(中國石油大學(華東) 化學工程學院,山東 青島 266580)

依據熒光標記的凝集素能夠與革蘭氏陽性菌細胞壁肽聚糖中的N-乙酰葡糖胺結合,卻無法透過革蘭氏陰性菌的細胞壁外膜與革蘭氏陰性菌肽聚糖層中的N-乙酰葡糖胺結合的特點,提出快速判定菌株革蘭氏染色反應的熒光法。針對供試的27株菌,該法革蘭氏染色反應判定的準確率高達98.76%,且不受菌齡影響。設置陽性對照抑制實驗,有利于提高判定準確率。與常規革蘭氏染色法相比,該法具有所需藥品少、簡單、快速、準確率高的特點,尤其在不可培養樣品的革蘭氏染色反應判定方面具有很大的應用前景。在微生物教學中可以考慮將該法與傳統革蘭氏染色法聯合使用,以提高教學效果。

微生物學實驗;革蘭氏染色;凝集素;快速鑒定

革蘭氏染色法作為細菌學一種重要的鑒別染色法,目前已成為微生物學實驗的基本內容之一。通過該實驗不僅能夠培養學生的實驗技能,而且能夠提高學生學習微生物學的興趣。但革蘭氏染色法對操作要求較高,染色結果受涂片厚度、媒染時間、脫色時間等多種因素影響[1-4]。對于初次接觸該方法的大學生來說,極易產生假陰性或假陽性結果,嚴重挫傷學生的實驗積極性。為減少革蘭氏染色反應的誤差率,本文探索了利用熒光標記的凝集素判定菌株革蘭氏染色反應的效果。結果表明,該法不僅準確率高、而且具有所需藥品少、簡單、快速的特點。因此,在微生物教學中可以考慮將該法與傳統革蘭氏染色法聯合使用,以提高教學效果。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗原理

N-乙酰葡糖胺是除支原體屬(Mycoplasmasp.)以外所有真細菌肽聚糖中的重要組成成分[5]。革蘭氏陽性菌(G+)肽聚糖位于細胞壁的外層,而革蘭氏陰性菌(G-)肽聚糖被細胞壁外膜所覆蓋(見圖1)。凝集素作為大分子物質,能夠與革蘭氏陽性菌肽聚糖中的N-乙酰葡糖胺直接結合,卻不能透過革蘭氏陰性菌細胞壁外膜與革蘭氏陰性菌的N-乙酰葡糖胺結合[6]。因此,通過檢測熒光標記的凝集素與細菌的結合情況,即可判定細菌的革蘭氏染色反應。

圖1 革蘭氏陽性和陰性細菌細胞壁構造的比較

1.2 試劑及菌種

1.2.1 實驗菌種

實驗選用新培養20 h的大腸桿菌(G-)、炭疽芽孢桿菌(G+)和金黃色葡萄球菌(G+)作為研究對象,考察熒光染色法的效果。為探索菌齡對熒光染色法的影響,實驗還考察了培養10、24、48、72、144 h的大腸桿菌、炭疽芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的熒光染色效果。為進一步檢驗該方法的準確度,實驗還研究了革蘭氏陽性菌(巨大芽孢桿菌、棒狀桿菌、嗜乳酸桿菌、藤黃微球菌、恥垢分枝桿菌、脲芽孢八疊球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、糞鏈球菌、緩癥鏈球菌、產膿鏈球菌),以及革蘭氏陰性菌(乙酸鈣不動桿菌、糞產堿桿菌、產氣腸桿菌、陰溝腸桿菌、克雷白氏肺炎菌、摩氏摩根菌、奇異變形桿菌、綠膿桿菌、熒光假單胞菌、施氏假單胞菌、深紅紅螺菌、液化沙雷菌和粘質沙雷菌)的熒光染色效果。

1.2.2 實驗試劑

異硫氰酸熒光素(FITC)標記的麥胚凝集素(WAG)用磷酸鹽緩沖液(pH 7.2)稀釋至100 mg/L[7]。

1.3 實驗步驟

(1) 取潔凈載玻片,滴加一小滴無菌水于載玻片中心。將接種環在酒精燈火焰上灼燒,冷卻后從斜面上分別挑取少量培養物(大腸桿菌、枯草芽胞桿菌或金色葡萄球菌)與載片上水滴均勻混合后,涂成直徑為10～15 mm稀薄圓形菌膜。自然風干后,將載片正面朝上并在酒精燈微小火焰上通過2～3次固定[8]。

(2) 滴加FITC標記的麥胚凝集素,染色30 s,用磷酸緩沖液緩慢沖洗,去水后置于激發波長為495 nm的熒光顯微鏡下觀察[7]。

2 結果與討論

2.1 熒光染色法效果

為更好地分析熒光染色法效果,實驗對比了測試菌株大腸桿菌、炭疽芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌在相差光學顯微鏡及熒光顯微鏡下的成像效果,見圖2(圖中A、B為炭疽芽孢菌,C、D為金黃色葡萄菌,E、F為大腸桿菌)。從圖中可以看出：在相差光學顯微鏡下3種測試菌株均可見；在熒光顯微鏡下,只有革蘭氏陽性的炭疽芽孢桿菌B和金黃色葡萄球菌D可見；革蘭氏陰性的大腸桿菌F由于不能與熒光標記的凝集素結合,所以在熒光顯微鏡下不可見。針對測試菌株,熒光染色法能夠判別菌株的革蘭氏染色反應,且該方法只需一步熒光染色,與傳統革蘭氏染色法相比,具有操作簡單、快速的特點。

圖2 菌株相差顯微鏡(左)和熒光顯微鏡(右)分析結果

2.2 菌齡對熒光染色法的影響

與傳統的革蘭氏染色法不同,菌齡對熒光染色法判定菌株革蘭氏反應的效果影響較小,如表1所示。培養10、24、48、72、144 h后,該法仍能準確區分出菌株的革蘭氏反應。通常細菌在適宜的培養條件下,十幾小時即可進入對數生長期,若菌齡過長,細菌將進入靜止期或衰亡期[9]。實驗結果表明,菌體細胞未成熟或已經老化,染色結果均不受影響,說明該法對生長緩慢的菌株,如厭氧菌,革蘭氏染色反應判定意義很大,且具有直接判定未培養樣品革蘭氏染色反應的潛力,尤其對不可培養菌株更具有重要的應用價值。

表1 培養時間對熒光染色法的影響

2.3 熒光染色法的準確率

除上述大腸桿菌、炭疽芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌外,實驗還探索了另外11株革蘭氏陽性菌和13株革蘭氏陰性菌的熒光法革蘭氏染色反應情況,結果見表2。實驗共進行81次熒光染色分析,其中僅有1次出現假陽性,準確率達98.76%。對該假陽性樣品進行重新劃線、分離,重新進行熒光法分析后,結果正確,說明該樣品熒光分析不正確的原因是因為受到污染。

此外,革蘭氏陰性菌株綠膿桿菌、熒光假單胞菌、施氏假單胞菌具有自熒光特性[10],在熒光顯微鏡下能夠呈現出微弱的光亮,但此光亮較革蘭氏陽性菌株的光亮明顯弱,且不受陽性對照抑制實驗影響,因此可判定為假陽性。陽性對照抑制實驗是在樣品固定后,首先滴加未標記的100 mg/L凝集素,作用30 s后洗去,再加標記的100 mg/L凝集素染色30 s,最后熒光顯微鏡觀察[11]。由于滴加的未標記的凝集素先與革蘭氏陽性菌肽聚糖層中的N-乙酰葡糖胺結合,即使再次滴加熒光標記的凝集素,也會使對照抑制實驗樣品的熒光與之前相比受到明顯抑制。但假陽性樣品卻不會出現抑制現象。因此,如果測試樣品的熒光較為微弱,可以用陽性對照抑制實驗進行佐證。

表2 27株菌熒光法革蘭氏染色反應判定結果

3 結論

針對供試的27株菌,熒光法菌株革蘭氏染色反應判定的正確率高達98.76%,即使是熒光較為微弱的假陽性樣品,也可以通過陽性對照抑制實驗進行佐證,提高判定準確率。同時該法受菌齡影響較小,在不可培養樣品的革蘭氏染色反應判定方面具有很大的應用前景。整體上,該法具有所需藥品少、簡單、快速、正確率高的特點。因此,在微生物教學中可以考慮引進該法與傳統革蘭氏染色法聯合使用,提高革蘭氏染色實驗的教學效果,達到培養學生實驗興趣和操作技能的目的。

References)

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[8] 王國惠.環境工程微生物學[M].北京:化學工業出版社,2005:291-297.

[9] 王蘭.現代環境工程微生物學[M].北京:化學工業出版社,2006:42-44.

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Fast determination of Gram-stain reaction for strains in microbial experiments

Liu Chunshuang,Zhao Chaocheng,Gu Yingying,Zhang Yunbo,Liu Fang

(College of Chemical Engineering,China University of Petroleum (East China),Qingdao 266580,China)

According to the characteristics that fluorescent-labeled wheat germ agglutinin capable of binding to N-acetylglucosamine in the out peptidoglycan layer of gram-positive bacteria,which could not penetrate the membrane of gram-positive bacteria to bind to N-acetylglucosamine,a fluorescent stain method using flurescent lectin is developed for the fast determination of Gram-stain reaction. For the 27 strains tested,the accuracy of developed method is as high as 98.76% and is not affected by the cell age. Setting positive control inhibition experiments could help to improve the accuracy of the developed method. Compared with the conventional Gram staining,this method has the characteristics of requiring fewer types of drugs,simple,fast and high accuracy,it has great application prospects especially in non-cultured samples. Therefore,in the teaching of microorganisms, it is possible to combine this method with traditional Gram staining to improve the teaching effectiveness.

microbial experiment;Gram-stain reaction;lectin;fast determination

2014- 06- 10 修改日期:2014- 08- 26

城市水資源與水環境國家重點實驗室開發基金項目(QA201009)；山東省自然基金項目(ZR2013EEQ030)；中國石油大學教改項目(SY-B201207,SY-B201408)

劉春爽(1981—),女,山東青島,博士,講師,碩士研究生導師,研究方向為環境工程微生物.

Q-33

B

1002-4956(2015)1- 0051- 03