脂聯素重組體對結腸癌細胞體外侵襲轉移的影響

王福青 周 偉 赫欣

脂聯素重組體對結腸癌細胞體外侵襲轉移的影響

王福青 周 偉 赫欣

目的 探討結腸癌細胞株SW-480中脂聯素受體的表達情況以及人脂聯素重組體對結腸癌體外增殖侵襲能力的影響。方法 通過RTPCR試驗檢測脂聯素受體1和受體2在結腸癌細胞株中的表達，然后將SW-480細胞分設對照組和脂聯素重組體作用(1、10、30、45、60μg/mL)組，作用后，分別以MTT法、劃線遷移實驗檢測脂聯素重組體對結腸癌細胞增殖、遷移能力的影響。結果 脂聯素受體1、2在該細胞株中均有表達，脂聯素重組體質量濃度高于10μg/mL時，對SW-480細胞生長具有明顯的抑制作用(P<0.01)，抑制作用隨著濃度增高而增強；當脂聯素重組體濃度大于30μg/ mL時，能明顯地降低腫瘤細胞體外侵襲遷移能力(P<0.01)，抑制率隨脂聯素重組體濃度的升高而增加，介于1.8%～42.0%之間。結論 脂聯素重組體在大于10g/mL時，可能對結腸癌細胞的增殖遷移產生較為明顯的影響。

脂聯素；結腸癌細胞；脂聯素受體；侵襲；轉移

近年來研究表明，脂肪組織不僅是一個被動的儲能器官，還可分泌多種具有重要生物活性的蛋白。其中脂聯素（adiponectin）就是其中一種重要的細胞因子，在與肥胖相關的疾病中起著重要的調節作用[1]。脂聯素的活性形式主要以球形結構域和全長形式存在，球形結構域比全長脂聯素能更有效地改善胰島素抵抗和增加脂肪酸氧化，具有更強的生物學活性。脂聯素有2種受體：AdipoR1和AdipoR2，其中AdipoR1與gAd具有高度的親和力，但與全長脂聯素親和力較低，AdipoR2對2種脂聯素的親和力相近，均為中等強度。脂聯素通過脂聯素受體使細胞產生相關應答反應并受脂聯素受體的影響[2]。

脂聯素生理作用的研究主要集中在與肥胖相關的一些疾病上，尤其是與Ⅱ型糖尿病胰島素抵抗相關的研究。但隨著研究的深入，發現脂聯素與乳腺癌[3]、子宮內膜癌[4]、前列腺癌[5]以及消化道癌癥等惡性腫瘤發生發展密切相關。眾多研究證據顯示脂聯素水平的降低可能與結直腸癌癥[6-7]的發生密切相關，但這些研究多集中于體內脂聯素水平以及動物模型實驗，在脂聯素的體外作用方面的研究較少。本實驗以體外培養的結腸癌細胞SW480為觀察對象，檢測細胞脂聯素受體的表達情況，并觀察不同濃度脂聯素球形結構域對結腸癌細胞SW480的生長、遷移的抑制作用，為結腸癌的治療提供新的思路及理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 L-15培養基購自GIBCO公司，血清購自四季青生物有限公司，脂聯素球形結構域購自愛迪博生物科技有限公司，RNA提取試劑盒、RT-PCR、Trizal、Taq酶以及DNA Ladder均購自寶生物工程有限公司。

1.1.2 細胞培養 結腸癌SW480細胞從上海中科院細胞庫購買，培養條件為含10%小牛血清的L-15培養液，于37℃、5%CO2的細胞培養箱中貼壁培養，傳代采用0.25%胰蛋白酶消化。

1.2 方法

1.2.1 脂聯素受體的表達檢測 SW480細胞在37℃、5%CO2培養箱中孵育48h，待細胞處于對數生長期時，用Trizal試劑盒提取總RNA。隨后，采用RT-PCR試劑盒合成cDNA，最后以此cDNA為模板對脂聯素受體AdipoR1和AdipoR2進行擴增。目標基因的引物序列分別是：（1）AdipoR1：上游引物序列：5-AAACTGGCAACATCTGGACC-3，下游引物序列：5-GCTGTGGGGAGCAGTAGAAG-3，全長約 300bp；（2）AdipoR2：上游引物序列5-ACAGGCAACATTTGGACACA-3，下游引物序列5-CCAAGGAACAAAACTTCCCA-3，全長約407bp。擴增程序為95℃預變性10min，隨后40個循環，每個循環為95℃變性20s，60℃復性15s，72℃延伸30s，循環結束后延伸10min。1%瓊脂糖凝膠電泳并在成像系統中觀察結果。

1.2.2 細胞增殖實驗（MTT法） 選取對數生長期人結腸癌SW480細胞，調整細胞密度至5×103/mL，接種于96孔板，培養過夜。加入脂聯素重組體，實驗分為空白對照組和5個質量濃度梯度(1、10、30、45、60μg/mL)，每組做3個平行孔，終體積為200μL，繼續培養48h。培養結束前4h，每孔加入20μL質量濃度為5mg/mL的MTT，繼續培養4h。棄上清，每孔加入100μL的DMSO，震蕩10min，492nm測定光密度值。

細胞生長抑制率(%)＝（1－實驗組OD值/對照組OD值）× 100%。

1.2.3 細胞遷移檢測 利用劃線法進行細胞侵襲實驗。參照Weis等方法進行劃痕遷移實驗。將結腸癌細胞以5×103濃度接種于24孔培養板上，待細胞鋪滿至80%，棄舊培養基，用20～200μL微量移液器槍頭在孔中央劃垂直痕，寬度為350μm，用PBS洗2次，在孔中分別加入3個質量濃度梯度的脂聯素(10、30、45、60μg/mL)和PBS陰性對照，每個濃度設3個平行，加培養基至500μL/孔，繼續培養24h，倒置顯微鏡觀察，每個復孔隨機選取3個視野進行拍照，計算遷移的細胞數，并測量劃痕邊緣的細胞向劃痕區遷移的距離。計算脂聯素對腫瘤細胞侵襲抑制率。

抑制率(%)=(對照組侵襲細胞數－給藥組侵襲細胞數)/對照組侵襲細胞數×100%。

2 結果

2.1 RNA的提取及脂聯素AdipoR1和AdipoR2在結腸癌細胞SW480中的表達 以結腸癌細胞RNA為模板，逆轉錄擴增出長度大約為300bp及430bp的2條片段，與預期的目的片段大小相符。見圖1。說明脂聯素受體AdipoR1和AdipoR2在結腸癌細胞SW-480中均有轉錄。

圖1 脂聯素受體表達情況

2.2 脂聯素重組體對結腸癌細胞SW480增殖的影響 用質量濃度為1～60μg/mL的脂聯素重組體處理SW-480細胞48h，MTT結果顯示，隨著脂聯素濃度的提高，細胞懸液的吸光度逐步下降。見圖2。通過計算測得脂聯素重組體對結腸癌SW480細胞生長的抑制率介于2.9%～37.6%之間。見圖3。各實驗組與對照組比較，當濃度大于10μg/mL時，具有顯著性差異，能夠明顯抑制腫瘤細胞生長作用（P<0.01）。

2.3 脂聯素重組體對結腸癌細胞SW480侵襲遷移能力的影響 用質量濃度為1～60μg/mL的脂聯素重組體處理SW-480細胞24h，觀察細胞的侵襲劃線遷移情況。見圖4。并計算遷移率，結果顯示，隨脂聯素重組體質量濃度的升高，其對細胞的侵襲抑制增加，抑制率介于1.8%～42.0%，當脂聯素濃度大于30μg/mL時，均表現出較為明顯的抑制腫瘤侵襲的作用。見圖5。

圖2 不同濃度脂聯素作用后的MTT結果

圖3 不同濃度脂聯素作用后對細胞增殖抑制率的影響

圖4 不同濃度脂聯素作用后結腸癌細胞SW480劃線遷移結果

3 討論

圖5 不同濃度脂聯素對結腸癌細胞SW480劃線遷移結果

脂聯素在糖類和脂類代謝中起著重要的作用，與肥胖、胰島素抵抗等多種代謝性疾病相關，但隨著研究的深入，有學者發現體內脂聯素水平的改變與癌癥的發生密切相關。關于脂聯素與癌癥之間的關系，目前的研究主要集中在臨床病例分析方面，脂聯素體外作用的研究相對較少。臨床研究顯示子宮肌瘤和子宮內膜癌患者血清脂聯素水平明顯低于對照組[4,8]，也有研究顯示脂聯素可能與前列腺癌的侵襲性有關[9]，一些學者還發現血清脂聯素水平與乳腺癌高風險呈明顯的負相關[10-11]，在結直腸腺瘤和結直腸癌相關性研究中，也表現相同的趨勢[6-7]。體外實驗顯示脂聯素可以抑制一些癌癥細胞的增殖，誘導凋亡，并對血管生成有抑制作用，從而阻斷細胞的遷移。Bub等[12]發現長脂聯素復合物明顯抑制了前列腺癌細胞的生長。Kang等[13]驗證生理濃度的脂聯素可以明顯抑制MDA-MB-231細胞系細胞的增殖，甚至引起細胞的凋亡。重組脂聯素和及其基因的過表達明顯地減少了MDA-MB-231細胞系雌性裸鼠的乳腺腫瘤形成[14]。Brakenhielm等[15]發現脂聯素可明顯抑制了雞胚尿囊膜和小鼠角膜中的新生血管形成，在荷瘤小鼠模型中，脂聯素通過減少瘤內新生血管形成造成腫瘤細胞凋亡，顯著抑制了小鼠原發腫瘤的生長。由此可見，脂聯素可能通過誘導新生血管生成及其他相關的基因的表達來影響腫瘤的生長與遷移。

結腸癌是常見的消化道惡性腫瘤，其發病率在世界上許多地區還呈逐年上升趨勢。病例對照研究發現，循環系統中低水平的脂聯素與男性結直腸癌發病風險呈負相關[16]，脂聯素缺乏的小鼠腹腔注射脂聯素可以抑制結腸上皮細胞的增殖，而且球型脂聯素比長鏈型的作用更加明顯。另外結腸癌組織中adipoR1和adipoR2陽性表達率分別達95%和88%。

目前，有關脂聯素對結腸癌細胞的增殖、凋亡、侵襲、轉移及其分子機制的研究國內外報道較少。本實驗檢測了結腸癌細胞株SW-480中脂聯素受體基因的表達情況，并研究了脂聯素球形結構域對結腸癌細胞增殖、遷移以及凋亡的影響。通過RTPCR檢測發現，2個受體基因AdipoR1和AdipoR2在該細胞株中均有所表達，脂聯素球形結構能夠有效地通過脂聯素受體作用于細胞，從而對細胞的生長和遷移產生影響。在隨后的MTT實驗中，通過鏡下觀察，發現在高于10μg/mL的濃度下，SW-480細胞數量顯著減少，細胞形態有所變化，出現收縮，結果顯示脂聯素球形結構域對細胞增殖具有明顯的抑制作用。而遷移實驗的結果顯示，在低于30μg/mL濃度的情況下，脂聯素對細胞增殖影響較小，而高于該濃度的條件下，隨著脂聯素濃度的增高，結腸癌遷移能力受到越來越大的影響。從實驗結果可以看出，當脂聯素球形結構域濃度達到一定程度時，能夠抑制結腸癌的生長和遷移，但脂聯素抑制腫瘤細胞的侵襲和轉移的細胞內信號通路尚不清楚,有待進一步深入研究。

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Objective To investigate the expression of adiponection receptor(adipoR) and the effects of recombinant adiponectin (gAd) on the proliferation and migration of human colon cancer cell line SW-480. Methods SW-480 cells were divided into control group and gAd(1, 10, 30, 45and 60μg/mL) treatment groups, the effect of gAd on proliferation of SW-480 cells was measured by MMT assay, the invasive and migration abilities were assayed by scratch test. Results The proliferating ability of the cell was inhibitied in a concentration-dependent manner, with the ranging from 2.9%-37.6%, the cell proliferation was dramatically inhibited when the concentration of gAd was higher than 10μg/mL (P<0.01); the migration were also inhibitied in a concentration-dependent manner, with the ranging from 1.8% - 42.0%, the migration ability of SW-480 cells were dramatically inhibited when the concentration of gAd was higher than 30μg/mL (P<0.01). Conclusion These results indicate that the adiponectin dramatically inhibited the proliferation and migration of colon tumor cell when its concentration is >10μg/mL．

Adiponection; Colon cancer cells; Adiponection receptor; Migration; Metastasis

10.3969/j.issn.1009-4393.2015.24.001

河南 462002 漯河醫學高等專科學校基礎醫學部 （王福青 周偉赫欣）