快速液相色譜法測定龜苓膏中綠原酸和蘆丁

李曉晶，于鴻，謝進（廣州市疾病預防控制中心，廣東廣州510440）

快速液相色譜法測定龜苓膏中綠原酸和蘆丁

李曉晶，于鴻，謝進
（廣州市疾病預防控制中心，廣東廣州510440）

摘要：建立高分離度快速液相色譜RRLC法同時測定龜苓膏中綠原酸、蘆丁的方法。采用采用ZORBAXSB-C18柱（150mm×4.6mm，1.8μm），乙腈-0.4%磷酸水溶液為流動相的梯度洗脫模式分離各測定組分，采用可變波長的方式測定相應組分的峰面積并計算樣品含量。綠原酸和蘆丁分別在0.009 42μg～0.471μg（r=0.999 9）和0.000 85μg～0.044 25μg（r=0.999 8）范圍內具有良好的線性關系；且平均加樣回收率分別為101.77%（RSD=1.2%，n=6）和99.84% （RSD=1.4%，n=6）；重復性試驗，2個成分含量的RSD均小于2.0%（n=6）。

關鍵詞：龜苓膏；綠原酸；蘆丁；高分離度快速液相色譜

龜苓膏是龜板、金銀花、槐花、地黃、土茯苓、茵陳、火麻仁、甘草等藥味組成，臨床用于虛火煩躁，口舌生瘡，津虧便秘，熱淋白濁，赤白帶下，皮膚瘙癢，癤腫瘡瘍等[1]。綠原酸和蘆丁作為龜苓膏中主要藥材金銀花和槐花的特征有效成分，具有廣泛的抗菌消炎、利膽、止血及增高白血球數量的作用[2]。目前針對蘆丁和綠原酸的測定國家已出臺了相應標準（GB/T22250-2008《保健食品中綠原酸的測定》），其中蘆丁的測定方法為紫外分光光度法、綠原酸的含量為高效液相色譜法[3-5]。為有效控制龜苓膏的質量，筆者通過相應的方法學考察建立了以高分離度快速液相色譜RRLC法同時測定龜苓膏中綠原酸和蘆丁2個指標成分含量的方法。結果表明，所建立方法簡便、快速、準確，可用于龜苓膏的質量控制。

1　儀器與試藥

1.1儀器

安捷倫1200型高分離度快速效液相色譜儀（RRLC），包括G1314-SL型二級管陣列檢測器（安捷倫科技有限公司，美國）；METTLER TOLEDO AG245型電子分析天平、METTLER TOLEDO XP26型電子分析天平（梅特勒-托利多國際股份有限公司，德國）；BRANSONB5510E-MT型超聲儀（必能信超聲有限公司，美國）。

1.2試藥

龜苓膏6個批次，生產廠家及自編號分別為：東莞市正膏坊龜苓膏有限公司，自編號1201、1202；廣西梧州雙錢實業(yè)有限公司，自編號1203、1204；廣州潘高壽天然保健品有限公司，自編號1205、1206。綠原酸對照品（批號110753-200413）和蘆丁對照品（批號11080-200707，含量90.5%）均購自中國食品藥品檢定研究院。乙腈為色譜純；水為超純水；甲醇和磷酸為分析純。

2　方法與結果

2.1色譜條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18柱（150 mm×4.6 mm，1.8μm）；流動相：乙腈（A）-0.4%磷酸水溶液（B），梯度洗脫條件見表1；檢測波長，采用可變波長分別測定綠原酸327 nm，蘆丁257 nm，見表1；流速1mL/min，柱溫：35℃；進樣體積：各2μL。

表1　梯度洗脫條件及相應的檢測波長

2.2溶液的制備

2.2.1混合對照品貯備液

取經五氧化二磷減壓干燥12 h以上的綠原酸和蘆丁各2mg，精密稱定，置10mL棕色量瓶中，加流動相制成綠原酸濃度為235.5μg/mL和蘆丁濃度為221.25μg/mL的混合對照品貯備液。

2.2.2混合對照品溶液

精密吸取“2.2.1”項下的混合對照品貯備液1mL，置5mL棕色量瓶中，加流動相稀釋至刻度，即得。

2.2.3供試品溶液

取本品，研細，取約15 g，精密稱定，置50mL棕色量瓶中，加流動相40mL，超聲處理30min，放冷，加流動相稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4陰性對照溶液

分別取按處方工藝制備的不含金銀花、槐花的陰性樣品，按“2.2.3”項下方法制得陰性對照溶液。

2.3方法學考察和樣品測定

2.3.1系統(tǒng)適用性及專屬性考察

分別吸取上述混合對照品溶液、供試品溶液和陰性對照品溶液各10μL，按“2.1”項下色譜條件進行檢測，記錄色譜圖。結果，供試品樣品中綠原酸、和蘆丁均與雜質峰完全分離，綠原酸和蘆丁的理論板數均不低于3 000，且陰性對照無干擾。色譜圖見圖1。

圖1　龜苓膏中綠原酸和蘆丁的色譜圖Fig.1　The chrom atogram of chlorogenic acid and rutin in Guiling Paste

2.3.2線性關系考察

精密吸取“2.2.1”項下的混合對照品貯備液6份各1.00mL，分別置50、25、10、5、2、1mL棕色量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，按“2.1”項下色譜條件測定，記錄色譜峰峰面積。以進樣量（X，ng）為橫坐標，以峰面積（Y）為縱坐標，得綠原酸和蘆丁的回歸方程分別為Y=20.380 6X-15.019 3（r=0.999 9）和Y=13.523 7X+ 2.780 8（r=0.999 8）。結果表明綠原酸在0.009 42μg～0.471μg和蘆丁在0.000 85μg～0.044 25μg范圍內均呈良好的線性關系。

2.3.3精密度試驗

精密吸取混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄峰面積。結果，綠原酸和蘆丁的RSD%分別為1.26%及1.06%。表明儀器精密度良好。

2.3.4穩(wěn)定性試驗

取同一份供試品溶液，分別于0、2、5、10、15、24 h進樣2μL，記錄峰面積。結果綠原酸和蘆丁的RSD%分別為1.48%及0.83%。表明供試品溶液在24h內穩(wěn)定。

2.3.5重復性試驗

取供試品（自編號：1201）適量，勻漿，按“2.2.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，分別進樣測定。結果，綠原酸和蘆丁的平均含量分別為14.732mg/kg和5.262 g/kg，RSD分別為1.83%和0.98%（n=6），表明本方法重復性良好。

2.3.6加樣回收率試驗

取同一批樣品（自編號：1201）6份，每份約7.5 g，置50 mL棕色量瓶中，分別精密加入含綠原酸0.115 67mg/mL和蘆丁0.040 32mg/mL的混合溶液各1.00m L，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，計算回收率。結果，綠原酸平均回收率為101.77%，RSD為1.2%；蘆丁的平均回收率為99.84%，RSD為1.4%。表明該方法回收率良好。結果見表2。

表2　綠原酸和蘆丁加樣回收試驗結果（n=6）Tab le2　The recoveriesof chlorogenic acid and rutin

2.3.7樣品測定

取本品，研細，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，用標準曲線法以峰面積計算樣品中各測定成分的含量，結果見表3。

表3　樣品含量測定結果（n=6）Table 3　The content resultsofsamples

3　結論與討論

3.1檢測波長的選擇

經DAD掃描（波長200 nm～400 nm），確定綠原酸和蘆丁各自的檢測波長分別為327 nm及257 nm。結果，在相應的測定波長條件下，2種成分均具有理想的響應值，且重復性良好。

3.2流動相的選擇

因待測定組分綠原酸呈顯弱酸性，所以選擇有機相-酸水溶液做流動相，當選擇甲醇（A）-醋酸水溶液（B）作流動相時，由于甲醇的黏度較大，在改變洗脫梯度時，整個系統(tǒng)的壓力會明顯升高，且基線波動較大；而選擇乙腈（A）-醋酸水溶液（B）作流動相時，基線波動較大；最后，選擇乙腈（A）-磷酸水溶液（B）作流動相時，得到了較滿意的色譜圖，經過比較，發(fā)現采用乙腈（A）-0.4%的磷酸溶液（B）作流動相，并按本文的梯度比例洗脫時，色譜圖的分離效果理想，保留時間適宜。

3.3小結

本方法對3個廠家6批龜苓膏中綠原酸和蘆丁2種成分進行了含量測定，結果表明本方法能夠在同一色譜條件下測定龜苓膏中主要成分的含量，有利于控制產品的質量。

參考文獻：

[1]陳潤階,馮亦,黎天德.黑色天然食品龜苓膏的營養(yǎng)保健作用[J].中國食品衛(wèi)生雜志,1994(S1):51-52

[2]杜延兵,裘愛泳.綠原酸生物活性,資源及其提取純化[J].現代食品科技,2006,22(2):250-252

[3]中華人民共和國衛(wèi)生部.GB/T22250-2008保健食品中綠原酸的測定[S].北京:中國標準出版社,2008:1-3

[4]吳婕.高效液相色譜法測定龜苓膏中的綠原酸[J].光譜實驗室, 2010,27(1):254-256

[5]時維靜,李立順,陸鳳琪,等.可見及紫外分光光度法測定中藥復方總黃酮的比較[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志,2008,18(6):1071-1073

DO I：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.19.041

收稿日期：2015-03-23

作者簡介：李曉晶（1982—），女（漢），主管技師，碩士，主要從事食品衛(wèi)生檢驗工作。

RRLC Simultaneous Determ ination of Ch lorogenic Acid and Rutin in Guiling Paste

LIXiao-jing，YUHong，XIE Jin
（Guangzhou Centers for DiseaseControland Prevention，Guangzhou 510440，Guangdong，China）

Abstract：To establish a RRLCmethod ofsimultaneously determining the contentof chlorogenic acid and rutin in Guiling Paste.Sampleswere separated by ZORBAX SB-C18column（150mm×4.6mm，1.8μm）.Acetonitrile -0.4%phosphoric acid wasmobile phasewith both a gradientelutionmode and a variable detectingwavelength in order to determine the concentration of the respective components simultaneously.Chlorogenic Acid and Rutin all had good linearity in the rangesof0.009 42μg-0.471μg（r=0.999 9）and 0.000 85μg-0.044 25μg（r=0.999 8），correspondingly.The average recoverieswere 101.77%（RSD=1.2%，n=6）；and 99.84%（RSD=1.4%，n=6），respectively.Repeatability experiments presented that RSD valuesof their contentswere less than 2.0%.

Keywords：Guiling Paste；chlorogenic acid；rutin；RRLC