超聲波輔助法對扇骨中蛋白質提取率的影響

劉達玉，肖龍泉，李杉杉，王加貝，王娟，鄒強，張崟（.成都大學生物產業學院，四川成都6006；.四川理工學院生物工程學院，四川自貢64000；.西華大學生物工程學院，四川成都6009）

超聲波輔助法對扇骨中蛋白質提取率的影響

劉達玉1，肖龍泉2，*，李杉杉3，王加貝1，王娟2，鄒強1，張崟1
（1.成都大學生物產業學院，四川成都610106；2.四川理工學院生物工程學院，四川自貢643000；3.西華大學生物工程學院，四川成都610039）

摘要：以豬扇骨等雜骨為原料，利用超聲波輔助提取骨中的蛋白質。在單因素試驗的基礎上，采用L9（34）正交試驗設計，以蛋白提取率和提取液色澤為指標，確定超聲波輔助提取骨蛋白的最佳工藝條件。試驗結果表明，骨蛋白的最佳工藝條件為液料比1∶4（g/mL），提取溫度120℃，提取時間60min，超聲波功率200W，超聲時間2min。在此試驗條件下蛋白提取率為62.36%。

關鍵詞：鮮骨；超聲波輔助提取；蛋白質

我國每年肉類總產量近6 000萬t，約占世界肉食總產量的1/4，居世界第一。在肉類生產中，每年產生近2 000萬t的各類畜禽骨[1]。盡管骨中的營養成分豐富[2]，但由于目前我國加工技術落后，骨中的營養物并沒有得到充分利用，不僅造成資源浪費，還給環境帶來巨大的壓力[3]。畜禽骨中含有豐富的鈣和可溶性蛋白，全面吸收畜禽骨中的鈣是最佳補鈣途徑之一[4]，蛋白水解物除包括部分人體必需的氨基酸外，幾乎含有構成蛋白質分子的全部氨基酸[5-6]；骨蛋白質中90%為膠原蛋白，具有增強皮下細胞代謝活性、延緩衰老的功效[7-8]。因此，畜禽骨骼蛋白質兼備高吸收率和高生物學效價特點，是一種較為優質的蛋白質資源[9]。在鮮骨中，由于豬扇骨（肩胛骨）本身的獨特生理結構，豬胴體分割后，豬扇骨等雜骨被單獨分割下來，其需求量小，購買者少，因而未得到充分利用。豬筒子骨含有豐富的骨髓，大多被用于熬湯，已經得到較好利用，其價格是扇骨價格的2倍～3倍，因此，采用扇骨等雜骨制備美拉德反應前體具有明顯的價格優勢。

超聲波輔助提取技術是一種新的提取分離技術，因具有提取時間短、效率高、提取液中雜質少、對有效成分結構破壞較小等優點[10]，故在食品工業得到廣泛的應用。超聲波技術是利用超聲波的空化作用（破碎細胞）和機械作用（強化傳質），使溶劑分子滲透到組織細胞中，使細胞中可溶性成分更好地與溶劑分子接觸，從而更好更快地釋放出來[11-12]。目前超聲波技術在松仁蛋白[13]、啤酒廢酵母蛋白[14]等提取方面已有報道，但鮮有骨蛋白提取的報道。蛋白質是美拉德反應的重要成分，提取液色澤反映了在提取過程中發生褐變程度，因此本文選擇蛋白提取率和提取液色澤為考察指標。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

豬扇骨：市購。95%乙醇、硫酸銅、硫酸鉀、硫酸、氯化鈉、硼酸、乙二胺四乙酸二鈉、鹽酸、酒石酸銨、三乙醇胺、氫氧化鈉等均為分析純；甲基紅（指示劑）、亞甲基藍（指示劑）、鈣羧酸（指示劑）。

1.2儀器與設備

JA3103N型電子天平：上海民橋精密科學儀器有限公司；JY92-IIN超聲波細胞粉碎機：寧波新芝生物科技股份有限公司；KDN-102C定氮儀：上海纖檢儀器有限公司；CR-400色差計：柯尼卡美能達（中國）投資有限公司；11-2-B5電熱恒溫鼓風干燥箱：上海躍進醫療器械廠；FW-400A傾斜式高速萬能粉碎機：北京中興偉業儀器有限公司；LDZX-75KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫療器械廠。

1.3骨蛋白的提取工藝

豬骨→預處理→粉碎→加水→超聲處理→高溫提取→過濾→靜置油液分離→濃縮→成品

1.4豬骨的預處理

將市購的豬扇骨砸碎后清水清洗2次～3次后浸泡1 h，去除血水，瀝干后將豬骨放置于-18℃凍庫冷凍保存，經冷凍的豬骨易于粉碎，最大粉碎顆粒不超過3mm×3mm×3mm。

1.5蛋白質提取率及鈣含量的測定

蛋白質含量：參考GB 5009.5-2010《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》；Ca含量：配位滴定法（EDTA法）[15]。

式中：m0為豬骨的質量，kg；m1為豬骨湯的質量，kg；c0為豬骨中蛋白質的質量分數，%；c1為豬骨湯中蛋白質的質量分數，%。

1.6色澤測定

色澤測定用色差計測定樣品的色差；L*值（Lightness，亮度），其值從0到100變化；0表示黑色，100表示白色（色差值感覺色差程度見表1）。

表1　NBS單位色差值感覺色差程度Table1　The degreeof different sensation of unit chrom atic aberration

1.7豬骨蛋白提取最佳工藝條件的確定

1.7.1料液比的確定

在提取溫度為110℃，提取時間為90min，料液比為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6（g/m L）分別進行骨蛋白提取。

1.7.2提取溫度的確定

根據確定的料液比，提取時間為90min，提取溫度分別選擇100、105、110、115、120、125、130℃考察溫度對蛋白提取率的影響。

1.7.3提取時間的確定

根據確定的最佳料液比、提取溫度、提取時間分別選擇30、45、60、75、90、105、120 min考察時間對蛋白提取率的影響。

1.7.4超聲功率的確定

根據確定的最佳料液比、提取溫度、提取時間，超聲功率分別選擇100、200、300、400、500W考察超聲功率對蛋白提取率的影響。

1.7.5超聲時間的確定

根據確定的最佳料液比、提取溫度、提取時間、超聲功率，超聲時間分別選擇0.5、1、2、5、10、15min考察超聲時間對蛋白提取率的影響。

1.7.6正交試驗

選取料液比、提取溫度、提取時間和超聲波功率進行四因素三水平L9（34）正交試驗設計，因素水平表見表2，以篩選最佳提取條件。

表2因素水平表Table 2　Factor in the levelof the table

2　結果與討論

2.1不同料液比對豬骨蛋白提取率及色澤的影響

在提取溫度為110℃，提取時間為90min，考察料液比對蛋白提取率的影響，結果如圖1所示。

圖1　料液比對蛋白提取率及色澤的影響Fig.1　Theeffect of solid-liquid ratio of protein extraction rateand the L*

料液比是豬骨質量與提取介質水的體積之比，它是影響豬骨蛋白提取率的一個重要因素。從圖1可以看出，隨著提取介質水的增加，豬骨蛋白的提取率和提取液L*值也隨之增加，當料液比在1∶3（g/mL）時，蛋白提取率變化趨于平緩。料液比小，提取過程中液相濃度變化快，提取阻力增大，提取率降低；提取介質水的增加，提取過程濃度變化相對緩慢，傳質推動力提高，提取率增加，當料液比在1∶2（g/mL）以上時，顏色變化存在較小色差。但水分過高會增加生產成本和后續處理難度，因此最佳料液比選擇1∶3（g/mL）較好。

2.2不同溫度對豬骨蛋白提取率及色澤的影響

在提取料液比為1∶3（g/mL），提取時間為90min，考察溫度對蛋白提取率的影響，結果如圖2所示。

圖2　溫度對蛋白提取率及色澤的影響Fig.2　Theeffectof tem peratureof protein extraction rateand the L*

從圖2可以看出，溫度對提取率影響很大。隨著溫度升高，蛋白提取率也相應增加。當溫度從100℃升高到110、120℃上升到130℃時，蛋白提取率變化較為明顯；在110℃到120℃變化相對平緩。110℃與120℃提取液冷卻后凝固較好，似果凍；100℃與130℃提取液冷卻后流動性較好。原因可能是100℃提取液蛋白提取率相對較小，冷卻后不易凝固。由于蛋白質與水之間的作用力主要是蛋白質中的肽鍵（偶極-偶極相互作用或氫鍵）或氨基酸的側鏈（離子化，極性基團，非極性基團）同水分子之間發生了相互作用。130℃下，可能引起蛋白質分子解聚、亞基單位伸展、蛋白質內部的極性基團和疏水基團的暴露、蛋白質分子表面電荷分布的加強，都能使蛋白質的水合作用加強，從而提高流動性。考慮到120℃以上提取液顏色褐變較為嚴重，又不利于節能，選取提取溫度為120℃較佳。

2.3不同時間對豬骨蛋白提取率和色澤的影響

在料液比為1∶3（g/mL），提取溫度為120℃情況下考察提取時間對蛋白提取率的影響，結果見圖3。

圖3　提取時間對蛋白提取率及色澤的影響Fig.3　The effectof extract timeof protein extraction rateand the L*

從圖3可以看出，隨著提取時間的增加，蛋白提取率逐漸增加，60min后蛋白提取率增加速率相對變緩。亮度值（L*值）隨著提取時間的增加而降低，提取時間在30 min～75min過程中提取液色澤變化輕微，75min～90min過程中色澤變化明顯，提取90min后L*值趨于平衡。綜合考慮，選取60min為提取時間較佳。

2.4超聲波功率對豬骨蛋白提取率及色澤的影響

在料液比為1∶3（g/mL），提取溫度為120℃，提取時間為60min，超聲2 s、間歇1 s，超聲時間20min，考察超聲波功率對蛋白提取率的影響，結果見圖4。

圖4　超聲功率對蛋白提取率及色澤的影響Fig.4　Theeffectof ultrasonic power ofprotein extraction rateand the L*

由圖4可知，當超聲波功率在100W～300W范圍內，隨著超聲波的功率增大，蛋白提取率逐漸增高。這是由于功率增大，空化效應增強，蛋白質溶出增加，同時超聲波的空化效應和機械效應會促進蛋白質向水相擴散。當超聲波的功率大于300W時，蛋白提取率上升變得特別緩慢，可能是由于超聲波空化作用達到一定的上限，空化作用力減弱，蛋白質分子黏滯性增強，阻礙蛋白溶出。

另外，隨著超聲功率增大，蛋白提取液顏色逐漸變乳白，脂肪出品率逐漸減少，功率為100W提取液較為澄清，氣味較淡，脂肪膩味較重；200W提取液色澤變化和乳化效果明顯；300W提取液顏色與200W提取液顏色相似，帶有更濃的香味；400W提取液色澤較300W變化強烈，呈乳白色，帶有輕微的脂肪氧化味。綜合考慮，本試驗最佳超聲功率選擇300W。

2.5超聲時間對豬骨蛋白提取率及色澤的影響

在料液比為1∶3（g/m L），提取溫度為120℃，提取時間為60min，超聲2 s、間歇1 s，超聲功率300W，考察超聲時間對蛋白提取率的影響，結果見圖5。

圖5　超聲時間對蛋白提取率及色澤的影響Fig.5　Theeffectof ultrasonic timeof protein extraction rateand the L*

由圖5可知，當超聲時間在0～2min范圍內，隨著超聲時間變長，蛋白提取率逐漸增高。這是由于時間增加，空化效應增強，蛋白質溶出增加，同時超聲波的空化效應和機械效應會促進蛋白質向水相擴散。當超聲時間超過2min后，蛋白提取率開始下降，這是由于超聲波空化作用達到一定的上限，空化作用力減弱，蛋白質分子黏滯性增強，阻礙蛋白溶出。

隨著超聲時間的增加，提取液色澤L*值逐漸增加，超聲時間超過1min后，提取液色澤（亮度）有較明顯的變化；超聲時間超過5min后的提取液相對不超聲提取液色澤存在強烈的色差，經超聲的提取液色澤得到明顯提升。超聲波處理2min后，考慮到蛋白提取率下降和L*值上升，且超聲波處理時間較短，再進行優化對實際生產貢獻不大，因此不將超聲處理時間納入正交試驗，本試驗確定超聲時間為2min。

2.6超聲波對骨湯中鈣含量的影響

在料液比為1∶3（g/mL），提取溫度為120℃，提取時間為60min，超聲2 s、間歇1 s，超聲時間2min，考察超聲波對骨湯中鈣含量的影響，結果見圖6。

由圖6可知，隨著超聲波功率增加，骨湯中鈣含量增加，當超聲功率大于200W時，鈣含量明顯增高。這是由于超聲功率增加，空化效應增強，同時超聲波打碎了細小骨顆粒，增加了骨湯中的鈣含量。

圖6　超聲波對骨湯中鈣含量的影響Fig.6　Theeffectof ultrasonic power of calcium content in bone soup

2.7豬骨蛋白提取工藝的正交試驗

通過單因素試驗選取料液比為1∶2（g/mL）～1∶4（g/mL），提取溫度為100℃～120℃，提取時間為30min～90min，超聲波功率為200W～400W，進行正交試驗，試驗結果見表3。

表3　正交試驗結果Table 3　Results oforthogonalexperim ent

表3　正交試驗結果Table 3　Results oforthogonalexperim ent

蛋白提取率/% 1　1（1∶2）　1（100）　1（30）　1（200）　18.97 2 1　2（110）　2（60）　2（300）　31.48 3 1　3（120）　3（90）　3（400）　56.56 4　2（1∶3）　1　2　3　23.33 5 2　2　3　1　37.25 6 2　3　1　2　46.82 7　3（1∶4）　1　3　2　24.13 8 3　2　1　3　33.83 9 3　3　2　1　62.36 k1　35.67　22.14　33.21　39.53 k2　35.80　34.19　39.06　34.14 k3　40.11　55.25　39.31　37.91極差R　4.44　33.11　6.10　5.39因素主→次　BCDA優方案　B3C3D1A3編號　A料液比/ （g/mL）B提取溫度/℃C提取時間/min D超聲功率/W

由表3可知，對豬骨蛋白提取率影響因素大小依次為B（提取溫度）＞C（提取時間）＞D（超聲功率）＞A（料液比），最優方案為B3C3D1A3，即提取溫度120℃，提取時間90min，超聲功率200W，料液比1∶4（g/mL）。

正交分析所用正交表各列除因子以外，無空列，故將離差平方和最小項（A項）作為誤差項，利用SPSS 13.0進行方差分析，分析結果見表4，提取溫度（B）對豬骨蛋白提取率影響顯著（Sig.＜0.05），而提取時間和超聲功率對蛋白提取率影響較小。

表4 正交試驗結果方差分析表Table 4　Varianceanalysisof orthogonal tests

2.8最優方案驗證試驗

根據正交試驗得出的優方案條件進行蛋白質提取，以蛋白提取率為考察指標，驗證其是否為最優方案，具體結果見表5。

表5 最優方案的驗證試驗Table 5　Resultof verification experim ents for optim al cooking conditions

表5結果表明：最優方案蛋白提取率僅高于9號試驗0.02%，由于9號試驗提取時間短于最優方案，從節能的角度考慮，選取9號試驗作為最優方案，即提取溫度120℃，提取時間60min，超聲功率200W，料液比1∶4（g/mL）。

3　結論

試驗結果表明：在料液比1∶4（g/mL）、提取溫度120℃、提取時間60min、超聲功率200W、超聲時間2 min時蛋白質提取率最高。料液比、提取溫度、提取時間與骨蛋白的提取率成正比；其中，溫度對蛋白提取率影響最為明顯，其次是提取時間、超聲功率，在考察的4個因素中，料液比對蛋白提取率影響最小。經超聲波預處理可提高骨蛋白提取率5%～6%，鈣含量明顯提高；當超聲功率在200W以上，超聲時間超過5min時，超聲處理對提取液顏色影響明顯。

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DO I：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.19.037

收稿日期：2014-09-16

作者簡介：劉達玉（1964—），男（漢），教授，碩士，主要從事食品加工等研究工作。

*通信作者：肖龍泉（1988—），男，碩士研究生，從事食品發酵方向研究。

Effect of Ultrasound-assisted M ethod on Protein Extraction Rate of Pig Scapu la

LIUDa-yu1，XIAO Long-quan2，*，LIShan-shan3，WANG Jia-bei1，WANGJuan2，ZOUQiang1，ZHANGYin1
（1.College of Biological Industry，Chengdu University，Chengdu 610106，Sichuan，China；2.Collegeof Biological Engineering，Sichuan University of Scienceand Engineering，Zigong643000，Sichuan，China；3.Collegeof Biological Engineering，Xihua University，Chengdu 610039，Sichuan，China）

Abstract：Proteinswere extracted from pig scapula and collected bonesby ultrasonic-assisted extraction.On thebasisofsingle factorexperimentsand orthogonalexperiment，the optimum conditionswasdetermined based on the protein extraction rate and soup color.The optimum conditions of extraction were as follows：the material-to-water ratiowas 1∶4（g/mL），extraction temperature was 120℃，extraction timewas 60 min，ultrasonic powerwas 200W，ultrasonic timewas2min.Under these conditions，the extraction rate of protein was62.36%.

Keywords：bone；ultrasound-assisted extraction；protein