分子模擬指導(dǎo)化學(xué)修飾對有機(jī)相中脂肪酶的性能強(qiáng)化

郭麗，徐剛，吳堅平，楊立榮

（浙江大學(xué)化學(xué)工程與生物工程學(xué)系生物工程研究所，浙江 杭州 310027）

脂肪酶對底物具有良好的立體選擇性，并且可以適應(yīng)包括疏水性有機(jī)溶劑在內(nèi)的非天然反應(yīng)環(huán) 境[1-4]，因此成為應(yīng)用最為廣泛的生物催化劑之一。長期以來，提高脂肪酶在有機(jī)溶劑中的催化性能是酶學(xué)研究的熱點。Kazlauskas 等[5]提出了脂肪酶對手性底物立體識別的分子機(jī)理，認(rèn)為脂肪酶的催化中心附近區(qū)域是一個容納底物的空腔結(jié)構(gòu)，這一空腔可以看作是由大小不同的兩個子空腔組成，即大、小口袋。當(dāng)手性底物靠近酶的催化中心時，一種構(gòu)型的手性中心上較大的基團(tuán)位于“大口袋”中、較小基團(tuán)位于“小口袋”中，則該構(gòu)型的底物受到的空間位阻較小，因而容易與催化中心結(jié)合而被催化；相反，如果較大基團(tuán)位于小口袋中，受到的空間位阻較大，因此與催化中心結(jié)合較為困難而不易被催化。脂肪酶正是依靠這種催化中心空腔大小口袋與底物手性基團(tuán)的性狀匹配來識別底物的手性構(gòu)型的[6-7]。

根據(jù)上述機(jī)理，很多研究者成功地通過基因修飾[8-12]或者化學(xué)修飾[13-16]等方法縮小脂肪酶的“小口袋”，使其不能容納原本勉強(qiáng)能夠容納的手性基團(tuán)，從而進(jìn)一步提高脂肪酶的立體選擇性。如 Chen 等[17]通過基因突變在產(chǎn)堿假單胞菌脂肪酶（Pseudomonas alcaligenes lipase，PaL）活性中心附近引入一個 Cys272，并使用 5,5-二硫代雙(2-硝基苯甲酸) 對半胱氨酸進(jìn)行特異性修飾，將其活性中心的小口袋減小，從而將該酶催化水解 L-薄荷醇丙酸酯的選擇性提高了3 倍。Tuomi 等[18]使用四甲基甲烷硝基化 PcL 的酪氨酸，將其活性中心的小口袋減小，從而將該酶催化水解 2-苯氧基-1-丙醇乙酸酯的選擇性由 E = 17 提高到了 36。

然而，上述修飾改造在提高選擇性的同時，卻嚴(yán)重降低了脂肪酶的催化活力（如 Chen 等的修飾脂肪酶殘余酶活僅有原始酶的 1/35）。此外，盡管脂肪酶能夠很好的適應(yīng)疏水有機(jī)溶劑，現(xiàn)有關(guān)于脂肪酶的選擇性強(qiáng)化，卻主要是針對水溶液中的反應(yīng)體系。對有機(jī)溶劑中脂肪酶立體選擇性的計算模擬，以及在此指導(dǎo)下的理性改造鮮有報道。本文基于分子動力學(xué)（molecular dynamics，MD）技術(shù)，開發(fā)了模擬有機(jī)溶劑中脂肪酶的立體識別的新方法。并運(yùn)用該方法，成功將 Kazlauskas 規(guī)則推廣到疏水有機(jī)溶劑體系中。以PcL 在正己烷中催化多種手性仲醇的選擇性轉(zhuǎn)酯化為模型，在模擬計算指導(dǎo)下對PcL 的催化空腔進(jìn)行特異性化學(xué)修飾，在不損失酶活的條件下，從而成功提高了其對多種手性仲醇的選擇性，最好E 值提高到了 48.1。

1 實驗部分

1.1 實驗材料

洋蔥假單胞菌脂肪酶（Pseudomonas cepacia lipase，縮寫為PcL，商品名Lipase PS）購自Amano Enzyme Inc.。胰蛋白酶（trypsin）購自北京 Promega 公司。手性仲醇，如仲丁醇、仲己醇、仲辛醇及其光學(xué)純對映體標(biāo)準(zhǔn)品購自 Tokyo Chemical Industry Co. Ltd.。酰基供體如乙酸乙烯酯和化學(xué)修飾劑 N-乙酰咪唑購于 Sigma-Aldrich Inc.。其余試劑均為分析純。

1.2 分子模擬

首先在 Discovery Studio 3.0 軟件中處理PcL蛋白結(jié)構(gòu)（PDB：2NW6）[19]。使用Calculate Protein Ionization and Residue pK 工具設(shè)定蛋白表面可電離氨基酸的質(zhì)子化狀態(tài)，并補(bǔ)全晶體結(jié)構(gòu)中缺失的氫原子，刪除晶體結(jié)構(gòu)中原有的配體小分子（POT612），保留全部結(jié)晶水（HOH615～893）和離子（CA613，NA614），再將催化中心三聯(lián)體 Ser87-His286-Asp264中組氨酸的質(zhì)子化狀態(tài)設(shè)為 HIP，從而得到受體蛋白結(jié)構(gòu)。使用 Discovery Studio 的 Sketching 工具生成底物（手性仲醇和酰基供體）同時與催化中心結(jié)合時的四面體過渡態(tài)結(jié)構(gòu)，并使用 LigandFit 工具[20]將其對接到PcL 活性中心，再以共價單鍵連接底物羰基碳原子與PcL的催化中心 Ser87-Oγ。

將得到的酶-底物過渡態(tài)復(fù)合物導(dǎo)入到 AMBER11 軟件[21]中，給復(fù)合物周圍加上六面體形的TIP3P 水溶劑盒子[22]，溶劑邊界到蛋白表面最遠(yuǎn)距離 10?（1?=0.1nm），并以Na+和Cl-平衡蛋白所帶電荷，進(jìn)行2.5ns 恒溫恒壓MD 以獲得接近真實情況的酶-底物復(fù)合物構(gòu)象。接下來進(jìn)行5ns 正己烷中的MD 模擬。從水溶液MD 結(jié)果中剔除后來加入的TIP3P 溶劑水，將提取出的帶有結(jié)晶水、離子的復(fù)合物導(dǎo)入Packmol 軟件，在其周圍加上六面體形的正己烷溶劑盒子，溶劑邊界到蛋白表面最遠(yuǎn)距離10?，再導(dǎo)入到AMBER11 軟件中進(jìn)行5ns 有機(jī)相MD 模擬。模擬結(jié)束后使用AMBER PTRAJ 工具分析結(jié)果。

1.3 手性仲醇的動力學(xué)拆分

手性仲醇（100μmol）、酰基供體（100μmol）、正己烷（1mL）與PcL 酶粉（10mg，約含 0.2mg 蛋白）充分混合，200 r/min 攪拌下 25℃溫浴一段時間后離心取上清液。反應(yīng)式如圖式1 所示。反應(yīng)液用氣相色譜分析[Hewlett-Packard 1890 型氣相色譜儀，Varian CP-Cyclodextrin-β-2，3，6-M-19 毛細(xì)管手性柱（50m × 0.25mm × 0.25μm）]。參照文獻(xiàn)[23]，計算反應(yīng)的對映體選擇性：E = ln[1 - c(1 + eep)]/ln[1 - c(1 - eep)]，其中eep為產(chǎn)物對映體過剩值，c 為底物轉(zhuǎn)化率，eep= {[(R)-酯] - [(S)-酯] } / { [(R)-酯] + [(S)-酯] }，方括號表示濃度。

圖1 PcL 催化拆分仲醇

1.4 PcL 的化學(xué)修飾

N-乙酰咪唑(N-acetylimidazole，NAI) 修飾酪氨酸殘基(Tyr)的方法參照文獻(xiàn)[24]，10mg 脂肪酶PcL溶于1mL 磷酸緩沖液中（50mmol/L，pH = 7.5），于2mL 平底離心管中配成酶液，加入5mg NAI，并加入200μL 界面激活劑正己烷，形成兩相界面，激活脂肪酶打開“蓋子”，從而利于口袋內(nèi)部氨基酸修飾[25]。冰浴下200r/min 攪拌反應(yīng)3h，使用脫鹽柱（HiTrap Desalting，GE Healthcare Corp.）將修飾酶液中的目標(biāo)蛋白與各種鹽離子和反應(yīng)后的修飾劑 NAI 進(jìn)行分離，最終溶解在去離子水中，立即置于 -80℃冰箱預(yù)凍 6～8h，然后真空冷凍干燥。冷凍干燥方法參照文獻(xiàn)[26]，凍干完成后將樣品取出，儲存于 -20℃保存待用。PcL 的剩余水解活力對修飾時間作圖得到修飾失活動力學(xué)曲線，水解酶活測定采用 p-NPP 法[27]。

1.5 修飾PcL 蛋白質(zhì)譜分析

化學(xué)修飾的PcL 蛋白通過十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）膠內(nèi)酶切方法獲取肽段[28]，采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）檢測方法，在 UltraFleXtreme 質(zhì)譜儀（Bruker Corp.）上進(jìn)行肽段質(zhì)譜分析，從而獲得修飾位點的相關(guān)信息。本實驗采取基質(zhì) α-氰-4-羥基肉桂酸（HCCA）對肽段進(jìn)行質(zhì)譜分析。PcL蛋白經(jīng)胰蛋白酶（trypsin）酶解的肽譜由 ExPASy PeptideMass（http：//web.expasy.org/peptide_mass/）在線工具檢索產(chǎn)生。搜索時漏切數(shù)選擇1 并顯示質(zhì)荷比 Z/A 大于 500 Da 的肽段序列。

2 結(jié)果與討論

2.1 PcL 在正己烷中對手性仲醇的立體識別的模擬計算

分別對PcL 在正己烷中催化(R)-及(S)-2-丁醇、2-己醇、2-辛醇與乙酸乙烯酯的轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)進(jìn)行了MD 模擬。以(R)-2-丁醇與乙酸乙烯酯的轉(zhuǎn)酯化為例，圖2顯示了2-丁醇與乙酸乙烯酯的乙酰基在PcL催化中心結(jié)合形成的過渡態(tài)構(gòu)象。圖中青色的部分為底物分子，其醇部較大的手性基團(tuán)（乙基）朝向催化空腔開口一側(cè)，其附近空間開闊，即為PcL 的“大口袋”，較小的手性基團(tuán)（甲基）朝向催化空腔內(nèi)側(cè)，附近被構(gòu)成空腔壁的氨基酸殘基所包圍，較為擁擠，即為“小口袋”。Tyr29殘基位于底物的大小手性基團(tuán)之間，是大小口袋的分界點。Tyr29的酚羥基朝向催化空腔內(nèi)側(cè)（即“小口袋”），在這一位置通過化學(xué)修飾連接合適的基團(tuán)，會使“小口袋”更為擁擠，根據(jù)Kaslauskaz 規(guī)則，這將提高PcL 對底物的選擇性。表1 列出了對Tyr29酚羥基進(jìn)行乙酰化修飾的PcL 以及原始的PcL 催化一系列手性仲醇的酶-底物過渡態(tài)結(jié)合能的計算數(shù)據(jù)。對于一對手性底物，酶與兩者的結(jié)合能差的絕對值越大，選擇性越好。表1 數(shù)據(jù)顯示，Tyr29-酚羥基乙酰化的PcL結(jié)合自由能差的絕對值明顯大于原始PcL，表明這一修飾能夠顯著提高選擇性。

2.2 對PcL 的 Tyr29 的化學(xué)修飾

NAI 是一種修飾酪氨酸酚羥基的特異性化學(xué)試劑。在水-疏水界面上用NAI 可以修飾PcL 靠近活性中心的Tyr 殘基。如圖3 所示，NAI 修飾PcL，修飾反應(yīng)持續(xù)6hPcL 的本征活力(p-NPP 水解活力) 已降至最低，表明NAI 修飾影響到了PcL 的活性中心附近區(qū)域。將原始PcL 酶液和脫鹽后的NAI 修飾PcL 酶液，進(jìn)行SDS-PAGE 分析，如圖4 所示。2 號泳道（原始PcL）和3 號泳道（修飾PcL）都僅在33 kDa 左右出現(xiàn)的單一條帶，與文獻(xiàn)報道的PcL 分子量一致[19]。這一電泳結(jié)果結(jié)合圖3 的修飾-失活過程，表明PcL 分子上僅有少數(shù)Tyr 被修飾。

用特異性切開 N-端為 Arg/Lys 殘基的胰蛋白酶水解PcL，可以得到特異性的定酶切肽指紋圖譜，譜中的肽段分子量可以通過軟件計算，通過MALDI-TOF-MS 蛋白質(zhì)譜表征，也可以精確測定這些肽段的分子量。通過對比計算預(yù)測的肽譜和測得的肽譜中特定肽段的質(zhì)量遷移，即可定位發(fā)生修飾反應(yīng)的氨基酸殘基。表2 給出了預(yù)測和測定的肽指紋圖譜數(shù)據(jù)，可以看到10 號肽段的分子量相比理論值（9 號肽段質(zhì)量）高出 42 Da，即乙酰基的分子量，而 Tyr29剛好位于這一肽段中，從而證明修飾特異性發(fā)生在 Tyr29位點。圖4 是原始PcL 的 MALDI-TOF-MS 原始圖譜，可以看到其中9 號肽段的分子量與表2 中的預(yù)測值一致，而圖5 中9 號肽段的響應(yīng)值幾乎消失，10 號肽段則與9 號肽段相差乙酰基的分子量。對比圖4 和圖5，也證明了修飾發(fā)生在位于10 號肽段上的 Tyr29殘基。

圖2 2-丁醇與乙酸乙烯酯的乙酰基在PcL 催化中心結(jié)合形成的過渡態(tài)構(gòu)象

表1 分子動力學(xué)模擬計算的PcL 與不同手性醇過渡態(tài)復(fù)合物的結(jié)合能

圖3 NAI 修飾PcL 失活動力學(xué)

圖4 脂肪酶PcL 蛋白的 SDS-PAGE 結(jié)果

表2 NAI-修飾的PcL 的MALDI-TOF 質(zhì)譜表征

圖5 原始脂肪酶PcL 的胰蛋白酶酶切蛋白樣品指紋圖譜

2.3 修飾 Tyr29 對選擇性的影響

圖6 NAI 修飾脂肪酶的胰蛋白酶酶切蛋白樣品指紋圖譜

前文表1 已經(jīng)對PcL 在正己烷中識別手性底物進(jìn)行了模擬計算，考察了PcL 催化3 種不同結(jié)構(gòu)仲 醇的不對稱轉(zhuǎn)酯化，Tyr29-酚羥基乙酰化的PcL 結(jié)合自由能差的絕對值明顯大于原始PcL，表明這一修飾能夠顯著提高拆分仲醇的選擇性，見圖6。進(jìn)而對PcL 進(jìn)行了 NAI 特異性修飾實驗研究，對表3 中考察的反應(yīng)而言，Tyr29-酚羥基乙酰化PcL 的選擇性較原始PcL 均有明顯提高，其中修飾PcL 催化 2-己醇與乙酸乙烯酯的轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)的選擇性提高最多，由原來的 E = 12.6 提高到 48.1，這與表1 的模擬計算是一致的。此外，在選擇性提高的同時，修飾PcL 催化這些仲醇底物的活力還有小幅提高。

表3 對PcL 氨基酸殘基側(cè)鏈的特異性化學(xué)修飾

3 結(jié) 論

根據(jù) Kazlauskas 規(guī)則，通過有機(jī)相中MD 模擬的新方法，提出了對PcL 催化空腔中的關(guān)鍵殘基進(jìn)行特異性修飾來提高酶的立體選擇性的研究策略。并通過MALDI-TOF-MS 表征和PcL 催化3 種不對稱轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)的實驗數(shù)據(jù)證明這一修飾的有效性。這一方法成功地在不損失酶的催化活力的情況下提高了其立體選擇性，并且其研究方法借助獨立于分子生物學(xué)之外的化學(xué)修飾方法，結(jié)合蛋白質(zhì)譜解析和分子動力學(xué)模擬等現(xiàn)代技術(shù)手段，開創(chuàng)了一條嶄新的靈活、高效、可靠的酶構(gòu)效關(guān)系研究。

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