谷氨酸棒桿菌發酵生產1，5-戊二胺的代謝流分析

黎 明，唐 奇，李東霞，隨樹珍，路福平

（工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津市工業微生物重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457）

谷氨酸棒桿菌發酵生產1，5-戊二胺的代謝流分析

黎 明，唐 奇，李東霞，隨樹珍，路福平

（工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津市工業微生物重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457）

為了提高糖類的利用效率，加強糖類代謝向生成尸胺的方向流動，提高尸胺產量，對谷氨酸棒桿菌合成尸胺的代謝網絡進行分析，找出影響尸胺合成的代謝流量分配規律和關鍵節點，并通過改變溶氧及添加輔酶NADPH對關鍵節點進行驗證.結果表明：6-磷酸葡萄糖和丙酮酸是影響碳源流向尸胺合成的關鍵節點，增強磷酸戊糖途徑（HMP）和三羧酸循環（TCA）可以弱化由6-磷酸葡萄糖生成6-磷酸果糖和由丙酮酸生成乳酸，促進碳源向合成尸胺的方向流動，從而有效地提高尸胺產量（產量增幅為77.8%）.該研究為高產尸胺的谷氨酸棒桿菌工程菌種改造以及發酵控制提供了理論基礎.

代謝途徑；尸胺；谷氨酸棒桿菌；NADPH；糖類

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

谷氨酸棒桿菌工程菌株（C. glutamicum）ATCC13032/pXLB（CDV-2）由本實驗室構建并保存.

1.1.2 培養基

種子培養基（g/L）：蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10.

發酵培養基（g/L）：葡萄糖50，蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10.

1.1.3 試劑與儀器

苯甲酰氯，純度為98%，上海金山亭新化工試劑廠；2，4-二硝基氟苯，分析純.

SBA-40C型生物傳感分析儀，山東省科學院生物研究所；高效液相色譜儀，大連依利特分析儀器有限公司；SinChrom ODS-BP型色譜柱，4.6，mm× 200，mm，C18填料.

1.2 培養方法

在平板上取一環谷氨酸棒桿菌接種到含有5，mL種子培養基中活化，以2%的接種量接入到發酵培養基中.待培養液吸光度為1.0時加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導劑誘導，到發酵中后期取樣，并測量相關代謝指標.

1.3 測定方法

利用生物傳感儀測定樣品中葡萄糖與乳酸的濃度.利用高效液相色譜儀測定樣品中氨基酸與尸胺的濃度.

1.3.1 尸胺的測定

取1，mL樣品加入5，mL具塞刻度試管中，加入500，μL 2，mol/L NaOH溶液、10，μL苯甲酰氯，37，℃水浴振搖20，min，隔5，min旋渦振蕩30，s，加入0.5，g NaCl、1，mL乙醚振蕩30，s靜置分層.把上層乙醚取至另一離心管中，待乙醚揮發完全，加入500，μL甲醇溶解，過膜后作為HPLC檢測用樣.柱溫：20，℃；流動相：100%乙腈、0.02，mol/L乙酸銨；梯度：0～5，min乙腈體積分數為30%，5～10，min乙腈體積分數為75%，10～15，min乙腈體積分數為30%.

1.3.2 氨基酸的測定

取2，mL離心管，依次加入300，μL體積分數1%的2，4-二硝基氟苯的乙腈溶液、300，μL 0.05，mol/L的衍生緩沖液NaHCO3和10，μL待測樣品，65，℃水浴1，h后，用0.05，mol/L的定容緩沖液KH2，PO4定容至2，mL，過膜后作為HPLC檢測樣品.柱溫：37，℃；流動相A為體積分數50%乙腈水溶液；流動相B為0.03，mol/L乙酸鈉溶液.洗脫梯度見表1.

表1 氨基酸洗脫梯度Tab. 1 Elution gradient of amino acids

1.4 尸胺代謝網絡及平衡模型的建立

1.4.1 代謝網絡的建立

建立代謝網絡的原則：（1）代謝流分析是基于擬穩態假設的基礎上的，即根據生理生化反應中物質的量的平衡，列出計量方程式，轉化為矩陣的形式來計算；（2）據文獻［11］所知，谷氨酸棒桿菌中糖類的利用途徑包括EMP、TCA和HMP途徑；（3）同功酶催化的反應按一個反應計算；（4）反應過程中無分支節點的反應按一步反應計算；（5）由于大量無效循環的存在，菌體中的ATP代謝并不平衡，因此不考慮ATP的總量的平衡；（6）根據谷氨酸棒桿菌合成尸胺的代謝途徑，表明絲氨酸、甘氨酸、蘇氨酸和乳酸是影響尸胺代謝流分配的主要副產物.基于以上原則，建立的代謝網絡如圖1所示.圖中：Glc為葡萄糖；Glc6P為6-磷酸葡萄糖；PEP為磷酸烯醇式丙酮酸；Pyr為丙酮酸；Fru6P為6-磷酸果糖；GAP為3-磷酸甘油醛；P3G為3-磷酸甘油酸；AcCoA為乙酰輔酶A；Ribu5P為5-磷酸核酮糖；Xyl5P為5-磷酸木酮糖；Rib5P為5-磷酸核糖；Sed7P為7-磷酸景天庚酮糖；E4P為4-磷酸赤蘚糖；OAA為草酰乙酸；α，KG為α-酮戊二酸；LAC為乳酸；Glu為谷氨酸；Ser為絲氨酸；Asp為天冬氨酸；Gly為甘氨酸；Thr為蘇氨酸；Lys為賴氨酸；Cadaverine為尸胺.

圖1 尸胺生物反應代謝網絡Fig. 1 Metabolic network of cadaverine synthesis

1.4.2 平衡模型的建立

根據穩態假設，中間產物的合成速率與它的代謝速率是相等的，根據這個條件，建立平衡方程，結果見表2.

表2 代謝節點反應速率方程Tab. 2 Reaction rate equation of metabolic nodes

將方程化為矩陣形式得出矩陣的秩為17，而一共有24個未知速率，因此，要解出該方程組，需要測定24-17=7個變量才能得出所有未知速率的解.在發酵中期，實驗測定了不同溶氧下谷氨酸、葡萄糖、尸胺、甘氨酸、乳酸、絲氨酸、蘇氨酸的濃度，數值微分后得出其消耗或生成速率，利用LINGO軟件分析得出其余未知速率的值，進而得出代謝通量并進行通量分析，得出代謝節點.

2 結果與討論

2.1 理想狀態與實際狀態下的代謝流分析

代謝網絡是一個多酶同步催化的復雜的反應體系，僅改變某一限速反應，對產物合成的影響往往不會很大［12］.因此，對谷氨酸棒桿菌合成尸胺的代謝途徑進行代謝流分析，目的在于從宏觀上把握影響尸胺合成的主要節點，從而有針對性地改造菌體及對尸胺發酵進行環境擾動.

根據上述建立的代謝網絡以及代謝方程式，在已知葡萄糖添加量而其他代謝產物未知的情況下，利用LINGO軟件可對其進行理想狀態代謝流計算，即在確定r1情況下，使r24達到最大時的代謝通量計算.以250，mL三角瓶50，mL裝液量的實際狀態下，通過對上述7種代謝產物測定，計算出實際代謝通量.計算得出的代謝通量見表3.

表3 理想狀態下的代謝通量與實際條件下的代謝通量Tab. 3 Ideal state and actual state of metabolic flux

由表3可推知：r2和r8在理想狀態下的代謝通量分別為0和100，而在實際條件下代謝通量分別為71.02和28.98，表明6-磷酸葡萄糖是影響尸胺合成的代謝流分配的關鍵節點之一；同理，r7和r18在理想狀態下的代謝通量分別為130和0，而實際狀態下的代謝流分別為0.81和183.00，表明丙酮酸是影響尸胺合成的代謝流分配的又一個關鍵節點.6-磷酸葡萄糖是由糖酵解途徑通向磷酸戊糖途徑的首個中間代謝產物，由上述計算結果對比表明：提高磷酸戊糖途徑的代謝通量可能是尸胺產量提高的關鍵所在.而丙酮酸亦是碳架進入TCA循環的首個中間代謝產物，因此，提高TCA循環的代謝通量也可能是尸胺產量提高的關鍵所在.磷酸戊糖途徑的生理意義在于生成磷酸核糖提供核酸合成原料，而核酸為細菌本身的重要組成部分，提高磷酸戊糖途徑的通量可以有效增加菌體的合成，生成輔酶NADPH提供代謝反應還原力為許多代謝反應提供前體.谷氨酸棒桿菌屬好氧菌，改變溶氧可以改變菌體的合成速率及代謝產物的量與種類，提高溶氧可以有效減少乳酸的產生，增加TCA循環的代謝通量，有效改變菌體代謝網絡的代謝流分配.因此，可以通過改變溶氧和加入輔酶NADPH作為擾動因子，對尸胺合成的代謝流分配及其關鍵節點進行驗證.

2.2 不同裝液量下的代謝流分析

搖瓶發酵簡潔方便，分析效率高，而且可以通過改變搖瓶的裝液量來控制發酵過程中的溶氧，從而進行不同溶氧條件下的代謝流分析.

本研究在250，mL三角瓶中，分別以50，mL和25，mL裝液量進行發酵實驗，測定發酵中后期的葡萄糖、谷氨酸、乳酸、蘇氨酸、絲氨酸、甘氨酸、尸胺的消耗或積累速率.用LINGO軟件進行分析，計算代謝通量，結果見表4.

表4 不同裝液量下的代謝通量Tab. 4 Metabolic flux under different liquid volume

由表4可知：當裝液量由50，mL減少到25，mL時，r7反應的代謝通量提高了81.5%，r18反應的代謝通量減小了2.73%，r24反應的代謝通量提高了12.0%，說明代謝流從合成乳酸向TCA偏移，導致合成尸胺的代謝流增加.由于減少裝液量可以適當提高溶氧，說明提高溶氧可以促使糖代謝向合成尸胺的方向流動，減少乳酸的合成.這與提高溶氧可以減少乳酸產生的結果是一致的［13］.代謝流向TCA偏移后，進入TCA循環的碳架相應增高，能夠合成尸胺的前體物質增加，進而增加了尸胺的產量.

2.3 添加NADPH后的代謝流分析

由2.1所知，為了證明提高磷酸戊糖途徑的代謝通量是提高尸胺產量的關鍵所在，在不同裝液量的基礎之上，添加終濃度為25，μmol/L的NADPH進行搖瓶發酵，測定上述7種物質的代謝速率，并進行代謝流分析，結果見表5.由表5可知：與未加入NADPH相比，加入NADPH后，以50，mL裝液量的實驗組，r8反應的代謝通量提高了18.8%；而以25，mL裝液量的實驗組，r8反應的代謝通量僅提高了2.84%.由此表明：在溶氧不足時，添加NADPH可以提高磷酸戊糖途徑的代謝通量，從而對提高尸胺產量有很大作用；而溶氧充足時，糖代謝向尸胺合成方向的流動明顯增加，添加NADPH對磷酸戊糖途徑的影響較小.可見，提高溶氧可以有效增加TCA循環以及HMP循環的代謝通量，提高菌體自身對尸胺合成所需NADPH的供給，明顯提高尸胺產量.因此，提高溶氧成為提高尸胺產量的最關鍵因素.在提高溶氧與加入NADPH兩方面的擾動下，尸胺的代謝通量由最初的5.00提高到7.20.而最終尸胺的產量提高了77.8%.

表5 添加NADPH后的代謝通量Tab. 5 Metabolic flux after adding NADPH

3 結 論

通過對谷氨酸棒桿菌發酵生產尸胺的代謝網絡進行代謝流分析，得出了影響尸胺產量的關鍵節點及與之相關的關鍵代謝途徑.分析表明：提高磷酸戊糖途徑和適當提高TCA循環途徑的代謝通量是提高尸胺產量的重要手段.在發酵中后期，提高溶氧可以提高TCA循環的代謝通量，加入NADPH可以提高磷酸戊糖途徑的代謝通量，兩者均從整體上改變菌體代謝流分配.后期可利用分子生物學手段改造關鍵節點，改變菌體的代謝流，提高尸胺的產量.

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責任編輯：周建軍

Metabolic Flux Analysis of the Fermentation of 1，5-diaminopentane in Corynebacterium glutamicum

LI Ming，TANG Qi，LI Dongxia，SUI Shuzhen，LU Fuping
（Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China）

To improve the yield of cadaverine and the efficiency of carbohydrate utilization，we analysed the metabolic network of the fermentation of cadaverine in Corynebacterium glutamicum and found the key nodes which influenced the production of cadaverine. Key nodes were verified by improving the dissolved oxygen and adding coenzyme NADPH. The results showed that the key nodes are glucose-6-phosphate and pyruvate. By enhancing the HMP pathway and tricarboxylic acid cycle，the processes of changing glucose-6-phosphate into fructose-6-phosphate and pyruvic acid into lactic acid were weakened，resulting in the carbon source fluiding to the synthesis of cadaverine，which could efficiently improve the yield of cadaverine（increased 77.8%）. The study provided a theoretical basis for the transformation of high-producing cadaverine Corynebacterium glutamicum and fermentation control.

metabolic pathway；cadaverine；Corynebacterium glutamicum；NADPH；carbohydrate

Q935 文獻標志碼：A 文章編號：1672-6510（2015）01-0009-05

10.13364/j.issn.1672-6510.20140012

1，5-戊二胺，又稱尸胺、1，5-二氨基戊烷、五亞甲基二胺或尸毒素，是生物胺類（包括腐胺、精胺、亞精胺和尸胺等）中的一種［1］.1885年，德國柏林的醫師Ludwig Brieger在腐敗的尸體中首次發現該胺類，該胺類以此得名尸胺［2］.尸胺是一種重要的平臺化合物［3］.已有技術可以將尸胺精煉后與己二酸共聚合成具有實用性的尼龍56，尼龍56是一種耐高溫的生物塑料［4-8］.

代謝流分析（metabolic flux analysis）是在物料質量守恒基礎上對實驗數據進行化學計量學分析的一種代謝網絡分析方法，運用代謝流分析可獲得大量的細胞內部代謝信息，已成功運用于多種氨基酸生物合成代謝分析的研究中［9］.

實驗室構建了一株產尸胺的谷氨酸棒桿菌［10］，它可以利用糖類發酵直接生產尸胺.為了提高糖類的利用效率，加強糖類代謝向生成尸胺的方向流動，提高尸胺產量，本文對谷氨酸棒桿菌重組菌株中尸胺合成的代謝網絡進行分析，找出影響尸胺合成的代謝流量分配規律和關鍵節點，并通過改變溶氧及增加輔酶NADPH的含量進行驗證，從而為以后的菌種改造以及發酵控制提供有利的理論支持.

2014-02-14；

2014-05-05

國家自然科學基金資助項目（21176190）；天津市科技支撐計劃資助項目（11ZCKFSY00900）

黎 明（1970—），男，湖北人，副教授，liming09@ tust.edu.cn.