丙泊酚后處理對大鼠肝缺血再灌注損傷時腎細胞凋亡以及Bcl-2，Bax的影響

劉臻 曹定睿

丙泊酚后處理對大鼠肝缺血再灌注損傷時腎細胞凋亡以及Bcl-2，Bax的影響

劉臻 曹定睿

目的 評價丙泊酚后處理對大鼠肝缺血再灌注時遠隔臟器腎臟細胞B淋巴細胞瘤/白血病-2（Bcl-2），Bcl相關X蛋白（Bax）的影響。方法 健康雄性SD大鼠54只，隨機分為3組（n=18）：假手術（S）組、缺血再灌注(IR)組、丙泊酚(P)組。每組再根據再灌注時間（2、4、6h）的不同各分成3個亞組，分別為S2、S4、S6、IR2、IR4、IR6、P2、P4、P6亞組。制備70%肝缺血再灌注模型，測定血液中胱抑素C（Cys-c），利用免疫組化方法檢測各組腎組織中Bcl-2蛋白和Bax的表達，TUNEL法檢測腎臟細胞的凋亡指數(AI)。結果 各組同一時間點相比，IR組和P組的Cys-c、Bcl-2、Bax蛋白含量，AI值均顯著高于S組（P＜0.05）。P組的Bcl-2、Bcl-2/Bax顯著高于IR組，Bax、Cys-c、AI值顯著低于IR組（P＜0.05）。結論 丙泊酚對肝缺血再灌注時腎臟損傷有保護作用，而其保護機制可能與調控Bcl-2、Bax蛋白的表達有關。

丙泊酚；肝缺血再灌注；腎損傷

肝缺血再灌注損傷(HIRI)是臨床外科常見的病理生理過程，可見于肝腫瘤切除、肝移植等手術。HIRI不僅會直接損傷肝臟本身，還會引起包括腎臟在內的其他遠隔臟器損傷[1]。而細胞凋亡在缺血再灌注（IR）損傷中發揮重要作用[2]。Bcl-2,Bax作為調控凋亡的蛋白，其表達水平間接反映了凋亡的情況，其中兩者此消彼長的關系與凋亡的程度密切相關[3]。丙泊酚因具有清除自由基的功效，從而可以產生一定的抗氧化作用[4]。腎臟是清除Cys-c的唯一場所，故腎小球濾過率決定了血清中Cys-c的濃度，且不受其他干擾因素(如炎癥、感染等)的影響。因此，Cys-c敏感性好、特異性高，可更好地反映腎小球濾過功能[5]，其濃度變化可體現腎臟的功能狀態。丙泊酚對肝缺血再灌注時肝臟的保護作用已得到肯定。已有研究發現HIRI發生時可以造成腎臟一定程度的損傷。目前，對HIRI的保護研究已從之前的關注肝臟本身發展到關注肝損傷時其他遠隔臟器的損傷，本研究通過建立HIRI模型，了解HIRI后腎臟的功能狀態，探討丙泊酚在HIRI中是否對腎臟有保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 健康成年雄性SD大鼠54只（體質量

180～250g，購自山西醫科大學實驗動物中心）。丙泊酚注射液（Astra Zeneca公司，意大利，批號JY174）。免疫組化試劑盒、原位細胞凋亡試劑盒、DAB染色試劑盒pv-6000（北京中杉金橋生物技術有限公司）。Bcl-2兔抗多克隆抗體（博士德生物公司，BA0414）。Bax兔抗多克隆抗體（博士德生物公司，BA0315）。

1.2 模型制備 大鼠于實驗前禁食12h，25%烏拉坦（1g/ kg）腹腔注射麻醉，平臥固定，消毒，上腹部正中切口，逐層分離顯露第一肝門后，暴露肝蒂、左、中葉，無創傷夾閉肝臟左、中葉的門靜脈，肝動脈分支，保留右葉、乳突葉、尾狀葉門靜脈分支。肝臟左，中葉表面顏色變灰顯示建立70%肝缺血模型成功。夾閉1h后恢復灌注，灰色部位恢復紅潤為再灌注成功標志。

1.3 實驗分組 54只大鼠隨機分為3組（n=18）：假手術（S）組、缺血再灌注(IR)組、丙泊酚(P)組。每組再根據再灌注時間（2、4、6h）分成3個亞組：分別為S2、S4、S6、IR2、IR4、IR6、P2、P4、P6共9個亞組。

1.3.1 假手術（S）組 僅暴露肝門，不做其他處理。尾靜脈以0.3mL/(kg·min)的速率持續泵注0.9%的生理鹽水10min，1h后關閉腹腔，此時刻視為再灌注起點，于2h時對S2組的6只大鼠行游離左腎，結扎腎蒂，取左腎標本，心室取血后當即離心，冷凍保存，處死動物。同樣4h時得到S4組的6份標本，6h時得到S6的6份腎及血清標本。

1.3.2 缺血再灌注(IR)組 暴露肝門，夾閉相應動靜脈，造成肝缺血損傷，同樣以0.3mL/(kg·min)的速率持續泵注0.9%的生理鹽水10min，1h后再灌注。分別在上述各時刻得到IR2、IR4、IR6亞組的血清及腎組織標本。

1.3.3 丙泊酚(P)組 暴露肝門，夾閉相應動靜脈造成肝缺血損傷，以3mg/(kg·min)的速率持續泵注丙泊酚注射液10min，1h后再灌，得到P2、P4、P6亞組標本。

1.4 腎組織病理檢查 取左腎下極組織甲醛固定，石蠟包埋，切片，染色，光鏡下觀察腎組織細胞形態。

1.5 腎組織Bcl-2,Bax蛋白含量測定 利用免疫組化二步法，檢測其表達情況。顯微鏡下每張切片隨機選取5個視野觀察，通過美國aperio公司的scanscope數字病理掃描系統軟件分析，得到陽性區域平均光密度（optical density OD）值。OD值的高低反映Bcl-2,Bax蛋白含量的表達水平。

1.6 原位細胞凋亡檢測 用TUNEL法對腎組織切片細胞凋亡行原位檢測，每個標本隨機選取5個視野，計算AI。

1.7 血清胱抑素檢測 抽取樣本后分離血清，冷凍保存，采用全自動血液生化分析儀(COBAS 501)測定Cys-c的濃度。

1.8 統計學方法 采用SPSS19.0軟件包對數據進行分析。各組實驗數據均以“x±s”表示。不同組間比較采用單因素方差分析，若結果差異有統計學意義，則繼續采用SNK檢驗進行進一步比較，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 組織病理學結果 S2、S4、S6亞組腎小球與腎小管均未發生明顯形態學改變，IR2、IR4、IR6各亞組腎小管的上皮細胞明顯腫脹變形，空泡樣改變，間質水腫，腎小管擴張，有部分脫落壞死細胞，可見管型，炎細胞浸潤，腎小管周圍血管淤血擴張明顯。P2、P4、P6亞組少量腎小管上皮細胞輕度水腫，管型罕見，腎小管周圍輕度淤血，極少炎細胞浸潤。

2.2 腎組織中Bcl-2,Bax蛋白含量及AI變化 所有結果進行組間比較。同一時刻，與S組比較，IR、P組Bcl-2,Bax蛋白含量，AI值顯著增加（P＜0.05）；與IR組相比，P組Bcl-2含量、Bcl-2/Bax值顯著增加，Bax含量、AI值顯著減少（P＜0.05）。見表1。

表1 3組不同時相肝組織Bcl-2蛋白、Bax蛋白及其比值(x±s)

2.3 血清中Cys-c含量變化 所有結果進行組間比較。同一時刻，與S組比較，IR,P組Cys-c含量顯著增加(P＜0.05)；與IR相比，P組Cys-c值顯著減小(P＜0.05)。見表2。

3 討論

缺血再灌注損傷的機制目前并未完全研究徹底，可能與細胞凋亡，氧自由基爆發性產生、鈣超載等有關，丙泊酚作為目前臨床廣泛應用的靜脈麻醉藥已經證實有抑制細胞炎癥因子釋放和抗氧化作用[7]。并在HIRI中對凋亡具有明確的抑制作用[8]。

本研究結果顯示，同一時刻，與IR組比較，P組Cys-c顯著降低，Bcl-2/Bax顯著降低，腎組織損傷程度減輕，且Bcl-2蛋白含量顯著增加，Bax蛋白含量顯著減少，提示丙泊酚對HIRI時腎臟的保護作用很可能與調控Bcl-2,Bax蛋白的表達相關，Bcl-2蛋白主要位于線粒體外膜，與抑制細胞凋亡有關，Bax蛋白位于胞質，起到促進細胞凋亡的作用。兩者的比例決定了細胞凋亡的程度。

綜上所述，丙泊酚通過上調Bcl-2，下調Bax的表達，使Bcl-2/Bax比值升高抑制凋亡，減輕損傷，丙泊酚后處理對HIRI時腎臟的損傷具有保護作用，可能與調控Bcl-2,Bax蛋白表達發揮作用，但具體的調控機制還有待進一步研究。

表2 3組不同時相AI及Cysc（x±s）

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Objective To investigate the effect of post-conditioning with Propofol on apoptosis and the expression of bcl-2,bax gene in renal tissue after hepatic ischemia-reperfusion injury and its mechanism. Methods Fifty-four healthy male SD rats were randomly divided into three groups, including sham group (S), ischemia-reperfusion group (IR), propofol group (P). According to the different periods after reperfusion, each group was further divided into 2-hour 4-hour and 6-hour reperfusion subgroups respectively (n=6 in each subgroup), named S2、S4、S6 subgroups,andI R2、IR4、IR6 subgroups, and P2、P4、P6 subgroups. Make the 70% hepatic ischemia-reperfusion model. The blood was sampled at the end of ischemia-reperfusion for assay of cystatin c（Cys-c）the apoptosis rate(AI) in ischemia-reperfusion renal tissure were measured by TUNEL method; the bcl-2,bax concentration were measured by immuno-histochemistry. Results Different group compared to the sametime. Blood concentrations of Cys-c ,AI, and the amount of bcl-2 and bax protein after reperfusion in group IR, and group P were higher than those in group S at matched reperfusion time points (P＜0.05).The amount of bcl-2 and bcl-2/bax in group P were higher than those in group IR, but the amount of bax, AI and the concentrations of Cys-c in group P were lower than those in group IR (P＜0.05). Conclusion Propofol can alleviate renal injury induced by hepatic ischemia-reperfusion in rats, in which the bcl-2 and bax protein may play important roles.

Propofol; Hepatic ischemia-reperfusion; Renal injury

10.3969/j.issn.1009-4393.2015.23.008

山西 030001 山西醫科大學附屬一院麻醉科 （劉臻 曹定睿）

曹定睿 E-mail:cdr128@126.com