超聲波輔助提取大球蓋菇總黃酮工藝優化

陳嬋，黃靖，丁玲（福建農業職業技術學院，福建福州350119）

超聲波輔助提取大球蓋菇總黃酮工藝優化

陳嬋，黃靖，丁玲（福建農業職業技術學院，福建福州350119）

摘要：主要研究了超聲波輔助提取大球蓋菇中總黃酮的提取工藝，研究了乙醇濃度、超聲功率、時間、料液比對大球蓋菇總黃酮提取率的影響。通過單因素試驗和正交試驗確定了大球蓋菇黃酮類化合物的優化提取工藝條件。超聲波優化提取工藝條件為：乙醇濃度30%，料液比1∶15（g/mL），超聲功率120 W，時間1 h，總黃酮的提取率為1.138%。

關鍵詞：大球蓋菇；總黃酮；超聲波輔助提取

大球蓋菇（Stropharia rugoso-annulata Farlow）別名皺環球蓋菇、皺球蓋菇、酒紅大球蓋菇、裴氏球蓋菇、裴氏假黑傘，是歐美各國人工栽培的著名食用菌之一，也是聯合國糧農組織（FAO）向發展中國家推薦栽培的食用菌之一。大球蓋菇栽培原料來源豐富，技術簡單，產量高，成本低，經濟效益可觀，在廣大農村極易推廣[1]。大球蓋菇菇味清香、肉質脆嫩、適口性好、產量高，其子實體中富含蛋白質、維生素、礦物質和多糖等營養成分[2]。

黃酮類化合物是存在于自然界的一大類的化合物，是一種對人體非常有用的活性物質，是許多藥品和保健品的主要成分，它具有殺蟲、抗病毒、保護心腦血管系統和祛痰的生理活性。黃酮化合物提取一般采用水、酸、或堿和有機溶劑對植物進行浸提，但細胞壁中的纖維組織會像一個天然屏障阻礙有效物質的提取的，且往往耗時費藥。陳君琛[3]等研究了大球蓋菇黃酮類化合物提取及抑菌性研究，結果表明：乙醇體積分數95%，料液比為1∶90（g/mL），溫度60℃，時間120 min，提取率為0.794%。超聲波具有很大的能量，它的強烈攪拌、振動、空化作用可以破壞細胞結構，加速有效物質的溶出，不僅可以提高提取效率，而且可以大大縮短時間，節省能源。本文采用超聲波輔助強化提取大球蓋菇總黃酮的含量，避免提取時間長，提取不完全的缺點，同時也提高了提取的效率，研究超聲波輔助提取工藝的最佳路線。該研究成果對為大球蓋菇的總黃酮的提取路線提供參考，同時為大球蓋菇的綜合開發利用提供參考。

1　材料、儀器與方法

1.1材料與試劑

大球蓋菇：產自福建省將樂縣。

蘆丁標準品（Aladdin chemistry co.Ltd蕓香葉苷，分析標準品，≧98%）；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、無水乙醇等所用試劑均為分析純。

1.2主要儀器

722s可見分光光度計：上海精密科學儀器有限公司；101-2型鼓風干燥箱：上海浦東榮豐科學儀器有限公司；KQ-300VDE超聲波清洗機：昆山市超聲儀器有限公司；BS224S電子天平：賽多利斯科學儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1大球蓋菇黃酮類化合物提取工藝流程

大球蓋菇→50℃烘干→粉碎→過60目篩→一定量的大球蓋菇加一定溶劑超聲波輔助提取→離心→檢測。

1.3.2標準溶液的配制與標準曲線的繪制[4]

精密稱取蘆丁標準品10mg，以60%的乙醇定容至5 mL，再加蒸餾水稀釋至10 mL。得到濃度為1.0 mg/mL蘆丁標準液。準確吸取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL蘆丁溶液于10 mL具塞刻度試管中，先加5%NaNO2溶液0.3 mL，搖勻放置6 min后，加入10%的Al（NO3）3溶液0.3 mL，搖勻放置6 min，最后加1 mol/mL NaOH溶液4.0 mL，用60%乙醇定容至刻度，搖勻后放置15 min，在510 nm下測定吸光度，以蘆丁含量為0的處理為空白對照，得標準曲線。

1.3.3樣品中總黃酮提取的測定及計算

稱取1 g的干燥樣品，用一定溶度的乙醇溶液以一定的料液比在一定功率下超聲波輔助提取一定時間，離心過濾，定容。取上清液0.3 mL，放入具塞刻度試管中，加入5%NaNO2溶液0.3 mL，搖勻放置6 min后，加入10%的Al（NO3）3溶液0.3 mL，搖勻放置6 min后，加1 mol/mL NaOH溶液4.0 mL，用60%乙醇定容至刻度，搖勻后放置15 min，以蘆丁含量為0的處理為空白對照，在510 nm下測定吸光度，并算出其總黃酮提取率。

總黃酮的提取率/%=提取總黃酮質量/原料的質量×100

1.3.4單因素試驗及正交試驗

乙醇溶度采用10%、30%、50%、70%、90%5個水平；料液比（干粉質量∶溶劑，g/mL）采用1∶5、1∶10、1∶15、1∶20 4個水平；浸提時間采用0.5、1、1.5、2、2.5 h 5個水平；浸提功率120、180、240、300 W 4個水平分別進行單因素試驗。根據單因素試驗結果確定正交試驗因素，選取L9（34）正交表做正交試驗，得出超聲波輔助強化提取大球蓋菇總黃酮的最佳工藝參數。

1.3.5驗證試驗及精密度試驗[5-6]

準確稱取1 g大球蓋菇粉末5份，以正交試驗得出的最佳提取工藝進行5次平行試驗，分別按照1.3.3中的方法進行總黃酮含量的測定。

以正交試驗得出的最佳提取工藝進行5次平行試驗，然后分別準確量取2.00 mL待測液于5個10 mL比色管中，分別按照1.3.3的方法進行總黃酮含量的測定。

1.3.6加標回收率[7]

準確移取已知總黃酮質量濃度的樣品溶液0.50 mL，平行5份，分別置于25 mL比色管中，再分別準確加入 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL的蘆丁標準溶液（0.2 mg/mL）。按1.3.2方法得總黃酮質量濃度。

加標回收率/%=（加標試樣測定值-試樣測定值）÷加標量×100

1.3.7數據分析

應用DPS數據處理系統進行數據分析。

2　結果與分析

2.1總黃酮的標準曲線

精密稱取蘆丁，配制得到濃度為1.0 mg/mL蘆丁標準液。根據方法1.3.2進行數據回歸，得標準曲線（蘆丁濃度Y和吸光值A的關系）。其回歸方程：Y（mg/mL）= 1.114 3X+0.004 8，R2=0.999 8。

2.2乙醇濃度對大球蓋菇總黃酮提取率的影響

準確稱取大球蓋菇干樣1 g，分別選用10%、30%、50%、70%、90%5個乙醇濃度，在超聲功率為300 W，料液比為1∶10（g/mL）的條件下提取1 h，考察乙醇濃度對大球蓋菇總黃酮提取率的影響見圖1。

圖1　乙醇濃度對大球蓋菇總黃酮提取率的影響Fig.1　Effects of alcohol concentrati on extraction rate of flavonoids

圖1表明：大球蓋菇總黃酮的提取率隨著乙醇溶度的增加先增加后減少，當乙醇濃度為30%時大球蓋菇總黃酮的提取率最大，提取率達到0.667%。原因可能在于：高濃度的乙醇溶液使得一些醇溶性雜質、色素、強親脂性成分溶出量增加，雜質與黃酮類化合物競爭與乙醇-水分子溶液體系結合，導致提取率下降。

2.3提取時間對大球蓋菇總黃酮提取率的影響

準確稱取大球蓋菇干樣各1g，在乙醇濃度為30%，料液比為1∶10（g/mL），功率300 W分別提取0.5、1、1.5、2、2.5 h，考察提取時間對大球蓋菇總黃酮提取率的影響。此外，本文采用連續超聲波輔助提取，不調整溫度的情況下，考察了在超聲波輔助提取大球蓋菇總黃酮過程中，浸提溫度的變化情況，結果見表1。

結果表明：隨著超聲波輔助強化提取時間的延長，浸提溫度也隨之增加，當提取時間為1 h時，溫度從室溫上升至45℃，提取2.5 h后溫度上升至68℃，而大球蓋菇總黃酮提取率隨著提取時間的延長先增加后下降，提取時間為1h時，提取率最高達到0.775%，原因可能在于在用超聲波輔助強化提取大球蓋菇總黃酮過程中，提取液的溫度不斷上升，提取時間過短時，總黃酮物質未充分溶出，提取時間過長，一方面由于浸提溫度的上升，長時間的超聲波反而造成總黃酮的降解，另一方面，隨著浸提時間的延長，其他的物質也隨之浸提出來，造成總黃酮提取率的下降。

表1　超聲波輔助強化提取大球蓋菇總黃酮過程中溫度的變化情況Table 1　The temperature change on extraction process of total flavonoids from ultrasound extraction

圖2　不同時間對大球蓋菇總黃酮提取率的影響Fig.2　Effects of supersonic time on extraction rate of flavonoids

2.4料液比對大球蓋菇總黃酮提取率的影響

準確的稱取1 g的大球蓋菇干樣，分別選用料液比為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20（g/mL）在超聲功率為300 W，乙醇濃度為30%條件下提取1 h，考察料液比對大球蓋菇總黃酮提取率的影響見圖3。

圖3　料液比對大球蓋菇總黃酮提取率的影響Fig.3　Effects of solid-liquid ratio on extraction rate of flavonoids

圖3表明：大球蓋菇總黃酮提取率隨著料液比的增加先增后減，料液比為1∶10（g/mL）時，總黃酮的提取率最高，隨之提取率下降。

2.5超聲功率對總黃酮提取率的影響

準確稱取1 g大球蓋菇干樣，分別選用超聲功率為120、180、240、300 W時，在料液比為1∶10（g/mL），乙醇濃度為30%提取1 h，考察超聲功率對大球蓋菇總黃酮提取率的影響。

圖4　超聲功率對大球蓋菇總黃酮提取率的影響Fig.4　Effects of supersonic power on extracti on rate of flavonoids

圖4表明：在超聲功率為120 W時，有利于黃酮類化合物的滲透和溶解，而超聲功率越大提取率降低，可能原因在于：超聲功率大可能破壞黃酮類物質，或超聲功率較大時導致其它物質析出，雜質溶出量增加。且實際提取過程中考慮到超聲波儀器使用壽命和節省電能，低功率可以更好的延長超聲波使用壽命。

2.6正交試驗結果分析

根據單因素試驗的結果，確定以乙醇濃度、超聲功率、料液比3種因素進行L9（34）進行正交試驗，以干燥后的大球蓋菇為試樣，提取時間為1 h，以總黃酮提取率為考察對象，從而得到大球蓋菇最佳提取條件。試驗設計及結果分析如表2所示。

表2　正交試驗結果Table 2　The results of orthogonal experiment

為判斷上述3種受控制的因素對試驗結果的影響，將正交試驗數據進行方差分析，結果見表3所示。

表3　正交設計方差分析表Table 3　The table of variance analysis of orthogonal experiment

結果表明：乙醇濃度、超聲波功率顯著水平均小于0.05都有明顯顯著性，料液比顯著水平（P>0.05）無明顯顯著性。有關D水平的影響因素也在顯著的水平，在超聲波輔助強化提取的過程中，提取液的溫度也隨之上升，因此，D水平的影響因素極有可能為超聲過程的溫度影響或為超聲波的提取時間，可以進一步研究討論。超聲波強化提取大球蓋菇總黃酮的最佳提取工藝條件為A2B1C3D1，即乙醇濃度為30%，超聲功率為120 W，料液比1∶15（g/mL）的條件下提取1 h。

2.7驗證試驗及精密度

按照選定的條件A2B1C3D1進行5次平行試驗，取平均值，驗證了正交試驗的結果。得到此條件下的提取率為1.138%，RSD值為0.82%，試驗結果穩定，重現性好。表明超聲波輔助提取大球蓋菇總黃酮工藝可靠，相對標準偏差小、所得數據精確，工藝穩定可行。

2.8加標回收率

根據1.3.6的方法，測定加標回收率，結果（見表4）計算平均回收率為96.0%，RSD=0.73%（n=5），說明方法的準確度好、結果可靠，用此工藝提取大球蓋菇總黃酮是可取的。

3　結論

與傳統的浸提法相比，超聲波輔助提取大球蓋菇總黃酮可有效的縮短提取時間，提取功率，是一種行之有效的提取手段。通過單因素和正交試驗，得到了超聲波輔助提取大球蓋菇總黃酮的最佳工藝條件：在乙醇濃度為30%，超聲功率為120 W，料液比1∶15（g/mL），時間1 h，提取率為1.138%。表明大球蓋菇中含豐富的總黃酮。

對正交試驗選定的條件進行驗證，表明本文所述方法提取的總黃酮結果穩定，試驗重現性好，結果可靠。精密度試驗及加標回收試驗法測得的結果表明，用紫外分光光度法測定大球蓋菇中總黃酮含量的準確度高。

表4　回收率試驗Table 4　The experiment of recovery rates

參考文獻：

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[2]張時,李萍,汪尚法．大球蓋菇的采后加工[J]．山東蔬菜,2010(1): 43-44

[3] 陳君琛,李怡彬,吳俐,等．大球蓋菇黃酮類化合物提取及抑菌性研究[J]．北京工商大學學報(自然科學版),2010,28(6):9-13

[4]張志良,瞿偉菁,李小方．植物生理學試驗指導[M]．北京:高等教育出版社,2009:51-54

[5]劉毅君,曾廣燁,李愛貞．超聲波輔助法提取紫蘇葉總黃酮的研究[J]．集美大學學報(自然科學版),2014,19(1):20-24

[6]翟碩莉．超聲波法輔助提取香蕉皮中黃酮的工藝研究[J]．食品研究與開發,2014,35(4):33-35

[7] 王寧,李遠志,徐莉珍,等．超聲波法提取柿子葉總黃酮工藝的研究[J]．現代食品科技,2008,24(7):687-690

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.24.030

收稿日期：2015-02-03

作者簡介：陳嬋（1980—），女（漢），講師，碩士研究生，研究方向：農產品加工及貯藏。

Study on Ultrasonic Wave Assisted Extraction of Flavonoids from Stropharia

CHEN Chan，HUANG Jing，DING Ling
（Fujian Vocational College of Agriculture，Fuzhou 350119，Fujian，China）

Abstract：The research aimed to study the extraction of total flavonoids from Stropharia with ultrasonic wave treatment．Based on the effect of different factors such as ethanol concentration，ultrasonic wave treatment，ultrasonic time and ratio of material to liquid，On the basis of single-factor experiments，the optimum extraction technology was determined through orthogonal experiments.30%ethanol as extracting agent，ratio of material to liquid of 1∶15 g/mL，processing 120 W with ultrasonic wave and extraction for 1 h．The optimized method is effici-ent，and the extraction yield of total flavonoids reached up to 1.138%。

Key words：Stropharia；flavonoids；ultrasound wave assisted extraction