足底電擊誘導(dǎo)樹(shù)鼠句條件恐懼記憶模型的建立及抹除

郭呈斌，張　晨，2，王烈成

足底電擊誘導(dǎo)樹(shù)鼠句條件恐懼記憶模型的建立及抹除

郭呈斌1，張晨1，2，王烈成1

摘要目的探索足底電擊誘導(dǎo)樹(shù)鼩條件恐懼記憶模型的建立及抹除方法。方法測(cè)定在無(wú)刺激條件下，樹(shù)鼩在明暗箱中的活動(dòng)規(guī)律；然后用梯度刺激實(shí)驗(yàn)測(cè)定合適的足底電擊電壓；最后用合適的電壓通過(guò)足底電擊誘導(dǎo)并建立實(shí)驗(yàn)組樹(shù)鼩條件恐懼記憶模型并抹除其記憶。結(jié)果正常條件下，樹(shù)鼩（n＝4）在暗箱中的停留時(shí)間明顯多于明箱中的停留時(shí)間（P＜0．01）；在兩明箱中，足底電壓梯度刺激實(shí)驗(yàn)顯示，隨著刺激電壓的增加，樹(shù)鼩（n＝6）在有刺激的隔間中的停留時(shí)間逐漸減少。12 V以后樹(shù)鼩在有刺激隔間與無(wú)刺激隔間的停留時(shí)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［12 V（P＜0．05）、16 V（P＜0．01）、20 V（P＜0．01）］；實(shí)驗(yàn)組（n＝4）暗箱用16 V刺激電壓足底電擊能夠形成明顯的恐懼記憶（P＜0．001）。在形成明顯的恐懼記憶后，在明箱中給予相應(yīng)的足底電擊4 d，實(shí)驗(yàn)組（n＝4）樹(shù)鼩在明箱中停留的時(shí)間逐漸減少，與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論樹(shù)鼩更趨于停留在暗箱中；16 V為較為適合的足底電擊電壓；條件恐懼記憶能夠被誘導(dǎo)并且被新的刺激完全抹除。

關(guān)鍵詞樹(shù)鼩；足底電擊；條件恐懼記憶形成和抹除；明暗箱中圖分類號(hào) R 338．2＋7；R 33-33

樹(shù)鼩（Tupaia belangeri）是一種小型哺乳動(dòng)物，屬于哺乳綱，攀鼩目（Scandentia）［1］。主要分布在熱帶和亞熱帶地區(qū)［2－3］。樹(shù)鼩身體內(nèi)的分子、細(xì)胞及解剖結(jié)構(gòu)較貓、犬、鼠等動(dòng)物更接近于人類［3］。研究［4－5］顯示，在獼猴和樹(shù)鼩中均能形成人類阿爾茲海默癥病理樣的老年斑，這在小鼠中是不能形成的。生物信息學(xué)分析［2］顯示，人類與樹(shù)鼩在阿爾茲海默病有關(guān)基因具有較高的同源性，這些結(jié)論為人類研究阿爾茲海默病提供了良好的實(shí)驗(yàn)對(duì)象。該研究旨在探索樹(shù)鼩在足底電擊刺激下形成條件恐懼記憶，以及該恐懼記憶的抹除方法，建立樹(shù)鼩條件恐懼記憶動(dòng)物模型，為進(jìn)一步研究樹(shù)鼩動(dòng)物模型提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1．1材料

1．1．1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性成年中緬樹(shù)鼩，體重120～180 g。購(gòu)自昆明實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，飼養(yǎng)室溫度22～25℃，相對(duì)濕度55%～75%，12 h光照／12 h黑暗的晝夜循環(huán)。動(dòng)物在進(jìn)行此實(shí)驗(yàn)前沒(méi)有進(jìn)行過(guò)其他的實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)操作均在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物操作及福利規(guī)范范圍內(nèi)進(jìn)行。

1．1．2實(shí)驗(yàn)裝置

實(shí)驗(yàn)裝置見(jiàn)圖1，有2個(gè)一樣的隔室。動(dòng)物逐個(gè)進(jìn)行測(cè)試，在每只動(dòng)物測(cè)試結(jié)束后，用75%的酒精進(jìn)行清洗以消除不同動(dòng)物之間氣味等相互影響。錄像用的攝像機(jī)固定在天花板上。在實(shí)驗(yàn)裝置的底部有數(shù)列銅質(zhì)電極，電極之間間隔1．5 cm，電刺激的電壓由穩(wěn)壓電源（0～30 V）提供。裝置的四面由聚丙烯注塑材料制成，裝置的上面由一層不銹鋼網(wǎng)制成，以防止樹(shù)鼩逃跑及方便錄像。每個(gè)隔室的內(nèi)徑尺寸為40 cm×40 cm×40 cm，在每個(gè)隔室的背面都裝有發(fā)光二極管（light emitting diode，LED），能夠在需要的時(shí)候?yàn)槊總€(gè)隔室提供照明。整個(gè)實(shí)驗(yàn)裝置處于黑暗的環(huán)境中，LED開(kāi)的隔室稱為明箱，LED關(guān)的隔室稱為暗箱。

1．2實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1樹(shù)鼩在明暗箱中的活動(dòng)規(guī)律探索（實(shí)驗(yàn)1）

實(shí)驗(yàn)包含3個(gè)階段：訓(xùn)練階段、適應(yīng)階段和實(shí)驗(yàn)階段。在訓(xùn)練階段，所有的動(dòng)物在無(wú)電刺激的情況下每天允許在明暗箱中自由活動(dòng)30min；在適應(yīng)階段，

2015－03－31接收

1．2．2樹(shù)鼩足底電擊不同電壓的測(cè)定（實(shí)驗(yàn)2）

該實(shí)驗(yàn)2個(gè)隔室皆為明室（即都用LED提供照明）。這個(gè)實(shí)驗(yàn)由2個(gè)階段組成：適應(yīng)階段和測(cè)試階段。適應(yīng)階段的實(shí)驗(yàn)和實(shí)驗(yàn)1相應(yīng)的階段一致。3 d適應(yīng)性訓(xùn)練之后進(jìn)行測(cè)試階段的實(shí)驗(yàn)。在測(cè)試階段，動(dòng)物有10 min的測(cè)試時(shí)間，在這10 min內(nèi)，隨機(jī)選擇1個(gè)隔室給予電刺激。電刺激的程序?yàn)椋好扛?0 s給10 s的電刺激，電壓從0 V遞增至20 V，增幅為4 V（圖2 A），通過(guò)箱底部的電極電擊動(dòng)物的足底。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在測(cè)試完1個(gè)電壓水平后再進(jìn)行下一水平電壓的測(cè)試。

1．2．3樹(shù)鼩條件恐懼記憶的建立（實(shí)驗(yàn)3）

該實(shí)驗(yàn)由4個(gè)階段組成：適應(yīng)階段、刺激前記錄階段、給予一刺激形成恐懼記憶階段、恐懼記憶維持階段。適應(yīng)階段的處理和實(shí)驗(yàn)2適應(yīng)階段一致。在恐懼記憶形成階段，將一適合的刺激電壓電擊動(dòng)物足底以形成條件恐懼，該階段共持續(xù)5 d（圖3，0～4 d），每天每只動(dòng)物記錄1次。該階段結(jié)束后刺激即移除，記錄繼續(xù)即過(guò)渡到恐懼記憶維持階段。在所有實(shí)驗(yàn)中，明暗箱的選擇是隨機(jī)的。刺激程序?yàn)椋?0 min內(nèi)每隔30 s給予10 s一合適恒壓電刺激。對(duì)照組不給刺激。

1．2．4樹(shù)鼩條件恐懼記憶的抹除（實(shí)驗(yàn)4）

在實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物形成條件恐懼7周后，啟動(dòng)記憶抹除實(shí)驗(yàn)。該實(shí)驗(yàn)包括3個(gè)階段即條件恐懼記憶維持階段、恐懼記憶抹除階段和記憶抹除后維持階段。在恐懼記憶抹除階段，在明箱中給予一適合刺激電擊動(dòng)物的足底，觀察條件恐懼消退情況。該階段共持續(xù)4 d（圖4，0～3 d），每只動(dòng)物每天記錄1次，該階段結(jié)束后則過(guò)渡到下一階段即記憶抹除后維持階段。在所有實(shí)驗(yàn)中，明暗箱的選擇是隨機(jī)的。刺激程序?yàn)椋?0 min內(nèi)每隔30 s給予10 s一合適恒壓電刺激。對(duì)照組不給刺激。

1．2．5數(shù)據(jù)收集

實(shí)驗(yàn)均在14∶00～18∶00之間進(jìn)行的。在測(cè)試階段的10 min內(nèi)，動(dòng)物在每個(gè)隔間內(nèi)的活動(dòng)情況由攝像機(jī)記錄，通過(guò)行為學(xué)分析軟件EthoVision XT 9（荷蘭瓦赫寧根大學(xué)Noldus公司）進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)出動(dòng)物在每個(gè)間隔內(nèi)的停留時(shí)間、移動(dòng)速度、移動(dòng)距離等。當(dāng)樹(shù)鼩通過(guò)兩隔室間隔板時(shí)，規(guī)定以動(dòng)物的中心為參考點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。

1．3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2　結(jié)果

2．1樹(shù)鼩明暗箱活動(dòng)規(guī)律探索

在沒(méi)有任何刺激情況下，讓樹(shù)鼩（n＝4）在明暗箱中自由活動(dòng)。結(jié)果表明，樹(shù)鼩在暗箱中停留時(shí)間為（476．773± 26．965）s，而明箱中只有（117．075±31．176）s。在暗箱中的停留時(shí)間是明箱中的4倍多，這表明，日常生活中，樹(shù)鼩更喜歡在暗箱中停留（t＝6．281，P＜0．01）。

2．2樹(shù)鼩足底電擊合適電壓的探究

在兩相同的明室中，一室內(nèi)給予不同電壓足底電擊，樹(shù)鼩（n＝6）表現(xiàn)出不同的活動(dòng)特征。0、4、8 V電壓下，樹(shù)鼩在2個(gè)隔室中的停留時(shí)間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0．05）。當(dāng)電壓增大到12 V時(shí)，樹(shù)鼩在有電刺激的隔間停留時(shí)間與0 V時(shí)的停留時(shí)間比較開(kāi)始明顯縮短（t＝3．429，P＜0．05）。隨著刺激電壓的加大，樹(shù)鼩在有電刺激的隔間停留時(shí)間越來(lái)越少［16 V（t ＝5．763，P＜0．01）、20 V（t＝7．117，P＜0．001）］，見(jiàn)圖2B。樹(shù)鼩的其他活動(dòng)指標(biāo)如移動(dòng)距離在6個(gè)電壓梯度下差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。移動(dòng)速度在16 V前差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05），20 V時(shí)移動(dòng)速度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝3．176，P＜0．05）。為了獲得顯著差異結(jié)果并且對(duì)樹(shù)鼩動(dòng)物福利的保護(hù)，在接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)中選用16 V電壓進(jìn)行刺激。

2．3樹(shù)鼩條件恐懼記憶的形成

動(dòng)物隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組（n＝4，暗箱中給予足底電刺激）和對(duì)照組（n＝4，無(wú)電刺激）。結(jié)果顯示，在刺激前，實(shí)驗(yàn)組樹(shù)鼩在明箱中停留時(shí)間所占比例約為16．67%，而對(duì)照組的約為23．44%，兩者比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）；在記憶形成階段，實(shí)驗(yàn)組樹(shù)鼩在沒(méi)有電刺激的明箱中的停留時(shí)間逐漸增加，與對(duì)照組比較前2 d （0～1 d）差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05），第3天以后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而對(duì)照組無(wú)變化。隨著刺激的繼續(xù)，實(shí)驗(yàn)組樹(shù)鼩在明箱中停留的時(shí)間逐漸增加，穩(wěn)定后實(shí)驗(yàn)組樹(shù)鼩在明箱中的停留時(shí)間隨天數(shù)的變化與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［F（22，132）＝7．690，P＜0．001］，表明恐懼記憶已形成。見(jiàn)圖3。

2．4樹(shù)鼩條件恐懼記憶的抹除

在結(jié)束恐懼記憶維持階段后，啟動(dòng)記憶抹除實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組不變，但與恐懼記憶形成實(shí)驗(yàn)不同的是實(shí)驗(yàn)組是在明箱中給予16 V的足底電擊。結(jié)果顯示，在抹除刺激施加前，實(shí)驗(yàn)組樹(shù)鼩在明箱中停留時(shí)間所占比例約為83．8%而對(duì)照組約為20．19%，兩者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）；在恐懼記憶抹除階段，實(shí)驗(yàn)組樹(shù)鼩在有電刺激的明箱中的停留時(shí)間逐漸減少，而對(duì)照組無(wú)變化。最后穩(wěn)定在與對(duì)照組無(wú)差別水平，兩組樹(shù)鼩在明箱中停留時(shí)間隨天數(shù)的變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［F（11，66）＝1．641，P＞0．05］，表明抹除階段過(guò)后，實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物的條件恐懼記憶被完全抹除，樹(shù)鼩條件恐懼記憶的抹除過(guò)程見(jiàn)圖4。

3　討論

研究［6］表明，樹(shù)鼩是一種晝行性動(dòng)物。但實(shí)驗(yàn)1結(jié)果表明，樹(shù)鼩更喜歡呆在暗箱中而不是停留在明箱中。可能是因?yàn)闃?shù)鼩膽子比較小，在暗箱中停留較多時(shí)間符合樹(shù)鼩的活動(dòng)特征。

學(xué)習(xí)記憶是一種高級(jí)的神經(jīng)活動(dòng)［3，7］。動(dòng)物等級(jí)越高，其學(xué)習(xí)記憶功能就越復(fù)雜。痛覺(jué)和恐懼是通過(guò)不同的方式進(jìn)行編碼的，但是有些地方是有交集的。比如痛覺(jué)刺激對(duì)恐懼記憶的形成有深遠(yuǎn)的影響［8－9］。因此，足底電擊是進(jìn)行恐懼記憶研究最常用的手段［10］。對(duì)樹(shù)鼩學(xué)習(xí)記憶方面的研究如水迷宮實(shí)驗(yàn)［11］，或食物誘導(dǎo)［12－13］，但這些實(shí)驗(yàn)都只能從某些方面測(cè)試樹(shù)鼩的學(xué)習(xí)記憶能力，對(duì)條件恐懼的痛覺(jué)記憶目前還沒(méi)有很好的實(shí)驗(yàn)方法來(lái)檢測(cè)。樹(shù)鼩作為靈長(zhǎng)類的近親，腦部的發(fā)育比嚙齒類更接近于人類［2］。本研究進(jìn)行了足底電擊誘導(dǎo)條件恐懼記憶的形成及抹除實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)2探討樹(shù)鼩足底電擊的合適電壓。結(jié)果表明，樹(shù)鼩對(duì)12 V的電壓就有一定的反應(yīng)，但速度的明顯變化是在16 V以上。綜合各方面的因素及動(dòng)物福利，將誘導(dǎo)條件恐懼的足底電擊電壓定在16 V。

巴普洛夫恐懼記憶理論認(rèn)為，恐懼記憶的形成經(jīng)歷3個(gè)階段：誘導(dǎo)與建立、強(qiáng)化和維持、消退［14］。本實(shí)驗(yàn)采用足底電擊刺激樹(shù)鼩誘導(dǎo)其建立對(duì)暗箱的條件恐懼記憶，結(jié)果顯示樹(shù)鼩的這種條件恐懼記憶存在時(shí)間超過(guò)8周而未消退。研究［8］表明新的重大刺激能夠使人或動(dòng)物忘記原有的恐懼記憶，因此在記憶抹除階段，在相反的箱子給予樹(shù)鼩刺激，以期樹(shù)鼩能夠抹除其恐懼記憶。結(jié)果顯示，在相反的箱子給予刺激后，樹(shù)鼩選擇性地抹除原來(lái)對(duì)暗箱的恐懼記憶，在隨后的維持階段并不是新舊兩種記憶共存，而是徹底地抹除了恐懼記憶。本實(shí)驗(yàn)顯示，新的重大環(huán)境變化可以抹除某些恐懼記憶，這就為將來(lái)治療恐懼癥提供了一個(gè)方向。

由于實(shí)驗(yàn)規(guī)模的限制，本實(shí)驗(yàn)未能對(duì)恐懼記憶形成的分子機(jī)制進(jìn)行研究。在將來(lái)的研究中，將著重對(duì)恐懼記憶形成及抹除的分子機(jī)制展開(kāi)探索，為將來(lái)臨床上治療恐懼癥提供理論指導(dǎo)。

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文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000－1492（2015）10－1426－05

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：81071075）；生物膜與膜生物工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題

作者單位：1安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，合肥2300322北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物膜與膜生物工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100871

作者簡(jiǎn)介：郭呈斌，男，碩士研究生；王烈成，男，教授，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：wangliecheng＠ahmu．edu．cn動(dòng)物被允許進(jìn)行環(huán)境及實(shí)驗(yàn)節(jié)奏的適應(yīng)，共持續(xù)3 d；在實(shí)驗(yàn)階段，每只動(dòng)物進(jìn)行10 min的測(cè)試（每次測(cè)試記錄前有3 min的適應(yīng)時(shí)間以消除應(yīng)激反應(yīng)帶來(lái)的誤差）。訓(xùn)練階段和適應(yīng)階段的數(shù)據(jù)不做統(tǒng)計(jì)。實(shí)驗(yàn)中隨機(jī)使用1個(gè)隔室作為暗箱以消除系統(tǒng)誤差。每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后每只樹(shù)鼩有1小塊糖果（約5 g）作為獎(jiǎng)勵(lì)。

A novel fear conditioning memory model formation and erasing by foot-shock in tree shrew

Guo Chengbin1，Zhang Chen1，2，Wang Liecheng1
（1Dept of Physiology，School of Basic Medical Science，AnhuiMedical University，Hefei230032；2State Key Laboratory of Biological Membrane and Membrane Biological Engineering，College of Life Sciences，Peking University，Beijing100871）

AbstractObjectiveTo investigate the way of fear conditioning memory model evoked and erased by foot-shock in tree shrew．MethodsFirst，detect the tree shrew activities regularly in light／dark box．Second，testa suitable voltage degree of foot shock on tree shrew．Third，investigate thememory formation and erasing of fear conditioning on tree shrew of trial group．Resu ltsThe duration of tree shrew（n＝4）stay in the dark-box was significantly longer than that of in the light box（P＜0．01）in normal condition．In the same environment of two light boxes，given different voltage degrees，the durations of tree shrew（n＝6）stay in the stimulating chamber gradually reduced and the durations of tree shrew stay had significant difference between stimulatus chamber and no stimulatus chamber when the stimulus voltage up to 12 V（P＜0．05），16 V（P＜0．01）and 20 V（P＜0．01）．The animal of trial group（n＝4）could build up the fear conditioningmemory of the dark box with the stimulus of 16 V foot-shock in the dark box（P＜0．001）．After formation of the fear conditioning memory，the same stimulus in light box appeared for 4 days．The durations of tree shrew stay in trial group（n＝4）decreased in light box，and there was nosignificant difference between the trial group and the control group．ConclusionTree shrew prefers to stay in the dark box．The suitable voltage for foot-shock on tree shrew is 16 V．The fear conditioningmemory can be evoked and erased by foot-shock．

Key wordstree shrew；foot-shock；fear conditioningmemory formation and erasing；light／dark box