凝血酶敏感激素蛋白酶4／5在骨性關(guān)節(jié)炎滑膜中的表達(dá)及意義

王　京，張琪琪，胡　勇，魏　偉

Wang Jing，Zhang Qiqi，Hu Yong，et al（Dept of Orthopedicst，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei　230022）

凝血酶敏感激素蛋白酶4／5在骨性關(guān)節(jié)炎滑膜中的表達(dá)及意義

王京1，張琪琪1，胡勇1，魏偉2

摘要目的研究凝血酶敏感激素蛋白酶4／5（ADAMTS4／5）在骨性關(guān)節(jié)炎（OA）滑膜組織及滑膜細(xì)胞中的表達(dá)及意義。方法取6例正常者滑膜組織和6例OA患者滑膜組織，Western blot法檢測標(biāo)本中ADAMTS4／5的表達(dá)，離體培養(yǎng)正常者滑膜細(xì)胞。白介素-1β（IL-1β）刺激正常滑膜細(xì)胞，測定滑膜細(xì)胞中ADAMTS4／5的表達(dá)量；IL-1RA（IL-1β阻滯劑）抑制IL-1β后，測定滑膜細(xì)胞中ADAMTS4／5的表達(dá)量。結(jié)果ADAMTS4／5在OA患者滑膜組織中表達(dá)較正常者滑膜組織均顯著增加；IL-1β刺激滑膜細(xì)胞后，ADAMTS4／5升高，IL-1RA可明顯降低IL-1β誘導(dǎo)的滑膜細(xì)胞中ADAMTS4／5的表達(dá)。結(jié)論IL-1β可以按照劑量依賴方式正向調(diào)節(jié)ADAMTS4／5的表達(dá)；ADAMTS4／5和IL-1β在OA病變機(jī)制中發(fā)揮重要的作用。

關(guān)鍵詞骨性關(guān)節(jié)炎；ADAMTS4／5；IL-1β；IL-1RA；滑膜細(xì)胞

骨性關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種以骨質(zhì)丟失、骨贅形成、關(guān)節(jié)畸形等為主要特征的退行性關(guān)節(jié)病，發(fā)病機(jī)制尚不明確。目前的觀點(diǎn)凝血酶敏感激素蛋白酶4（aggrecanas4，ADAMTS4）主要是由炎性細(xì)胞因子誘導(dǎo)產(chǎn)生［1］。凝血酶敏感激素蛋白酶5 （aggrecanas5，ADAMTS5）主要是由病理性軟骨細(xì)胞和滑膜成纖維表達(dá)［2］。ADAMTS4／5被認(rèn)為能引起滑膜炎癥性反應(yīng)，最終導(dǎo)致OA的發(fā)生。白介素-1β （interleukin-1β，IL-1β）是在滑膜炎癥反應(yīng)中比較重要的一種細(xì)胞因子，其作用是能夠刺激滑膜細(xì)胞增殖，產(chǎn)生相關(guān)降解酶，從而破壞關(guān)節(jié)軟骨，最終引起關(guān)節(jié)炎癥，與OA的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系。目前ADAMTS4／5在滑膜組織和細(xì)胞中的表達(dá)仍存在爭議。該研究采用Western blot法分別測定滑膜組織、細(xì)胞蛋白表達(dá)量，旨在探討ADAMTS4／5、IL-1β和OA之間的關(guān)系。

1　材料與方法

1．1病例資料

收集2012年9月～2013年1月于安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科就診的OA患者的滑膜組織6例（OA組），另選因意外損傷導(dǎo)致股骨頸骨折患者的滑膜組織6例（對(duì)照組）。其中男4例，女8例；年齡35～85（57．50±7．35）歲。

1．2主要儀器

SDS-PAGE電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Tek公司）；－80℃超低溫冰箱（日本三洋公司）；Bioshine ChemiQ 4600熒光及化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（中國Bioshine公司）；酶聯(lián)免疫檢測儀、組織勻漿器（上海歐翔科學(xué)儀器有限公司）；恒溫箱（上海一恒科技有限公司）；顯微鏡（日本Olympus公司）；搖床、離心機(jī)（安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所提供）。

1．3主要試劑

20%FBS培養(yǎng)液、IL-1β、白介素1受體拮抗劑（interleukin-1 receptor antagonist，IL-1RA）、0．1%牛血清白蛋白（BSA）的DMEM培養(yǎng)基、去離子水、分離膠緩沖液、濃縮膠緩沖液、PVDF膜、TEMED原溶液、Tris、脫脂奶粉、PBS緩沖液和吐溫PBS緩沖液（上海南基生物科技有限公司）；兔抗ADAMTS4／5多克隆抗體（英國Abcam公司）；山羊抗兔二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；RIPA緩沖液和SDS-PAGE加樣緩沖液（中國碧云天生物技術(shù)研究所）；ECL顯影液（美國Thermo公司）。

1．4方法

1．4．1滑膜細(xì)胞的分離、培養(yǎng)以及傳代

采用組織塊法，標(biāo)本在無菌條件下處理后（滴加2滴含20% FBS培養(yǎng)液），將組織塊剪碎成約1 mm×1 mm× 1 mm大小，使用20%FBS處理后放置于培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中約3 h。翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使組織塊浸沒于培養(yǎng)液中，繼續(xù)培養(yǎng)當(dāng)檢測細(xì)胞數(shù)值達(dá)到1×105個(gè)／ml時(shí)，傳代至 24孔培養(yǎng)板中待用。

1．4．2組織蛋白鑒定

1．4．2．1組織的取材

經(jīng)術(shù)前談話已經(jīng)獲得患者本人和家屬同意后，標(biāo)本取自安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院關(guān)節(jié)外科中心髖、膝關(guān)節(jié)置換的患者，共取出12例，標(biāo)本為新鮮滑膜組織，帶無菌手套后使用手

2015－05－26接收

2安徽醫(yī)科大學(xué)藥理研究所，合肥230032

1．4．2．2組織蛋白提取

取對(duì)照組及 OA組各1 g，電子稱精確測量后平均分為4組（加入約2．5 m l的蛋白裂解液），使用組織勻漿器小心充分研磨（冰浴條件下），直至完全研磨至無固態(tài)物質(zhì)存留即加入1．5 ml EP管標(biāo)序。分別取40μl蛋白樣品至標(biāo)序?yàn)?、2、3、4的EP管中，1、3號(hào)設(shè)為對(duì)照組，2、4號(hào)設(shè)為 OA組。加 Loading Buffer緩沖液煮沸10 min，冷卻后，于－80℃冰箱保存。

1．4．2．3細(xì)胞蛋白提取

滑膜細(xì)胞傳代至 60 mm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞充分融合，收集細(xì)胞，棄培養(yǎng)基，加入PBS 2 m l清洗培養(yǎng)皿1次，棄PBS。0．05%胰酶2 m l處理，37℃溫育1 min。鏡下觀察細(xì)胞變形后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至一個(gè)1．5 ml EP管中，10 000 r／min離心3 min，4℃條件下棄EP管上清液，1 m l預(yù)冷的PBS清洗沉淀，10 000 r／min離心3 min，4℃條件下PBS清洗1次棄上清液，－80℃凍存待裂解，向細(xì)胞沉淀中加入200μl RIPA緩沖液，混勻后冰上放置40min，10 000 r／min離心15 min，4℃，將上清液（約250μl）轉(zhuǎn)移至一個(gè)新的EP管中。

1．4．2．4Western blot法測定滑膜組織蛋白表達(dá)水平

10%SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，37℃條件下5%脫脂牛奶封閉1．5 h，用ADAMTS4／5抗體（1∶200），β-actin（1∶1 000）孵育，4℃過夜，加入山羊抗兔標(biāo)記二抗（1∶10 000），37℃溫育1 h，ECL底物化學(xué)發(fā)光顯影，檢測各樣本中ADAMTS4／5蛋白灰度值，分別與對(duì)應(yīng)的β-actin蛋白灰度值比較，計(jì)算兩者比值。

1．4．2．5Western blot法檢測滑膜細(xì)胞蛋白表達(dá)水平

采集的蛋白樣品（－20℃）凍存后，10%SDSPAGE凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，37℃條件下5%脫脂牛奶封閉2 h，用ADAMTS4／5抗體（1∶100），β-actin（1∶500）孵育，4℃過夜，加入山羊抗兔標(biāo)記二抗（1∶5 000），37℃溫育0．5 h，ECL底物化學(xué)發(fā)光顯影，檢測各樣本中ADAMTS4／5蛋白灰度值，分別與對(duì)應(yīng)的β-actin蛋白灰度值比較，計(jì)算兩者比值。

1．4．3IL-1β與IL-1RA對(duì)滑膜細(xì)胞蛋白表達(dá)的測定

1．4．3．1IL-1β誘導(dǎo)對(duì)照組滑膜細(xì)胞

對(duì)照組滑膜細(xì)胞貼壁生長后，更換DMEM培養(yǎng)基（含0．1%BSA）繼續(xù)培養(yǎng)24 h，更換DMEM培養(yǎng)基（含1、10 ng／m l IL-1β），各濃度分別做8個(gè)復(fù)孔，分別為試驗(yàn)組2、3；對(duì)照組為試驗(yàn)組1。作用時(shí)間為6 h，檢測各樣本中ADAMTS4／5蛋白灰度值，分別與對(duì)應(yīng)的βactin蛋白灰度值比較，計(jì)算兩者比值。

1．4．3．2IL-1RA降低IL-1β誘導(dǎo)水平

試驗(yàn)組1、試驗(yàn)組4（IL-1RA 500 ng／ml＋I(xiàn)L-1β10 ng／m l）、試驗(yàn)組5（IL-1RA 500 ng／ml＋I(xiàn)L-1β10 ng／ml）。IL-1RA預(yù)處理作用時(shí)間為2 h，后用IL-1β繼續(xù)作用24 h，檢測各樣本中ADAMTS4／5蛋白灰度值，分別與對(duì)應(yīng)的β-actin蛋白灰度值比較，計(jì)算兩者比值。

1．5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2　結(jié)果

2.1滑膜組織中ADAM TS4／5的表達(dá)情況

OA組ADAMTS4／5的表達(dá)明顯高于對(duì)照組（F＝422．911、905．154，P＜0．01）。提示ADAMTS4／5在OA滑膜中高表達(dá)。見圖1。

2．2滑膜細(xì)胞蛋白表達(dá)水平

IL-1β作用滑膜細(xì)胞后，隨著劑量的增加，ADAMTS4的表達(dá)量增加但不明顯，ADAMTS5的表達(dá)量明顯增加（F＝60．100，P＜0．01），提示ADAMTS5的表達(dá)隨著IL-1β刺激量增加呈逐漸升高的趨勢（P＜0．01）。見圖2。

2．3正常滑膜細(xì)胞的形態(tài)

倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞核呈卵圓形，位于細(xì)胞中間，邊界清楚，核仁清晰可見；IL-1β作用后細(xì)胞數(shù)量發(fā)生明顯變化，而使用IL-1RA后數(shù)量未見明顯變化。見圖3。

2.4IL-1RA對(duì)IL-1β誘導(dǎo)水平的影響

IL-1β刺激人滑膜細(xì)胞后，ADAMTS4／5的表達(dá)量均高于對(duì)照組，使用IL-1RA抑制后，ADAMTS4和ADAMTS5的表達(dá)量均明顯降低，結(jié)果顯示IL-1RA可以降低IL-1β誘導(dǎo)水平。見圖4。

3　討論

OA的產(chǎn)生是一個(gè)多種因素共同參與作用的過程，目前治療方法是使用以緩解疼痛及對(duì)抗炎癥反應(yīng)的藥物與為主，如非甾體抗炎藥或類固醇激素。但目前國內(nèi)外尚無根治OA的方法，并且在治療OA上存在許多爭議，因此找到治療OA的新靶點(diǎn)或者靶向治療藥物顯得尤為重要。

研究［3］顯示，在體外培養(yǎng)的正常人或動(dòng)物的滑膜細(xì)胞中僅有少量的IL-1β，但是在人OA的滑膜組織提取的細(xì)胞上清液中卻能檢測出高表達(dá)的IL-1β。ADAMTS又被稱作為蛋白聚糖酶，是國內(nèi)外這些年克隆提取的新型酶類，屬新的金屬蛋白酶家族成員［4］，是帶有凝血酶敏感蛋白樣模體的裂解素。在白介素1家族中IL-1β與IL-1RI（白細(xì)胞介素1受體I型）的結(jié)和力最低，但I(xiàn)L-1RA與IL-1RI的結(jié)合力幾乎不可逆轉(zhuǎn)，因此IL-1RA被認(rèn)為是IL-1β較為有效的抑制劑［5］。ADAMTS的家族成員中，特別是存在于人或動(dòng)物軟骨和滑膜組織中的蛋白聚糖酶1／2，又被分別稱為ADAMTS4／5。被認(rèn)為是可以降解關(guān)節(jié)軟骨的一類。

研究［6－7］表明，IL-1對(duì) ADAMTS5 mRNA的表達(dá)沒有或僅有輕微影響。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面用IL-1或維甲酸處理牛滑膜，并不改變ADAMTS4／5 mRNA的表達(dá)［2］。在人滑膜細(xì)胞培養(yǎng)中，Bondeson et al［8［9］報(bào)道在軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)中，用IL-RA可以阻滯IL-1和腫瘤壞死因子-α的誘導(dǎo)作用。本研究結(jié)果顯示ADAMTS4／5在OA滑膜組織中均高表達(dá)；IL-1β可誘導(dǎo)人正常滑膜細(xì)胞的增殖，能夠產(chǎn)生高表達(dá)的ADAMTS4／5；不同劑量的IL-1β作用滑膜細(xì)胞后，ADAMTS4表達(dá)量增加不明顯，ADAMTS5表達(dá)的量逐漸增加，提示兩種酶表達(dá)水平有差異；IL-RA能夠抑制IL-1β誘導(dǎo)細(xì)胞蛋白表達(dá)，但因?yàn)闆]有設(shè)立精確時(shí)間點(diǎn)及IL-1β作用時(shí)間不同導(dǎo)致統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果出現(xiàn)不一致。

研究［10－12］顯示 p38-TAK1-NF-κB信號(hào)通路可能參與調(diào)節(jié)ADAMTS4／5的表達(dá)。由于經(jīng)費(fèi)及時(shí)間限制，未能進(jìn)一步討論。找出信號(hào)通路中的作用靶點(diǎn)和特異性抑制劑，為治療OA提供新的依據(jù)顯得尤為重要。在OA的研究中，仍有很多問題尚待解決。ADAMTS4和ADAMTS5在軟骨中的表達(dá)及相關(guān)機(jī)制，在人體其他組織中蛋白聚糖酶起到的作用等均有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。

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Wang Jing，Zhang Qiqi，Hu Yong，et al
（Dept of Orthopedicst，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei230022）

中圖分類號(hào)R 684．3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000－1492（2015）10－1475－04

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號(hào)：81173075）

作者單位：1安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科，合肥230022

作者簡介：王京，男，碩士研究生；胡勇，男，博士研究生，副教授，責(zé)任作者，E-mail：hy．in163＠163．com術(shù)刀片剔除脂肪等非滑膜組織后，所取標(biāo)本分為兩組，所有標(biāo)本袋上需注明患者詳細(xì)信息。正常組（供細(xì)胞蛋白鑒定）和OA組（供組織蛋白鑒定）分別放置于無菌EP管及含生理鹽水的標(biāo)本袋中，后于－80℃冰箱凍存。

The expression and significance of thrombin-sensitive hormone protease4／5 in osteoarthritis synovial

AbstractObjectiveTo research the expression of thrombin sensitive hormone protease 4（ADAMTS4／5）in the OA synovial tissue and cells．Methods6 cases of OA synovial tissue and 6 cases of normal synovial tissue were taken during the operation．The expression quantity of specimen ADAMTS4／5 in cases wasmeasured by Western blot，respectively．The normal group and OA group synovial cellswere cultured in vitro．The normal group synovial cellswere induced by IL-1βor IL-1βblockers（IL-1RA）．The expression quantity of ADAMTS4／5 weremeasured by the supernatant fluid．ResultsADAMTS4／5 in OA synovial tissue expressed significantly than the normal group．The group of IL-1βwas obviously higher，IL-1RA could block IL-1βand induce synovial cells to produce ADAMTS4／5．ConclusionADAMTS4／5 and IL-1βplay an important role in synovial tissue inflammatory change；IL-1βcan be in accordance with the dose-responsemanner positive adjustment ADAMTS4／5 expression．

Key wordsosteoarthritis；ADAMTS4／5；IL-1β；IL-1RA；synovial cells