白芍總苷對糖尿病大鼠肝臟內質網應激的調節作用

夏玲玲，周仲松，謝琴秀，朱啟金

白芍總苷對糖尿病大鼠肝臟內質網應激的調節作用

夏玲玲，周仲松，謝琴秀，朱啟金

摘要目的探討白芍總苷（TGP）對糖尿病大鼠肝臟損害的保護作用是否與抑制內質網應激（ERS）有關。方法建立鏈脲佐菌素（STZ）誘導的糖尿病模型，隨機分為對照組、模型組、TGP（50、100、200 mg／kg）給藥組。應用油紅O與Masson染色對肝組織行病理檢查；采用免疫組化法檢測肝組織ED-1表達；采用Western blot法檢測GRP78、p-Perk及p-Eif2α的表達。結果TGP給藥可降低糖尿病大鼠肝重增加及肝組織總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）及游離脂肪酸（FFA）水平。模型組肝細胞油紅O染色評分明顯高于對照組（P＜0．01）；TGP各給藥組評分明顯低于模型組（P＜0．01）。Masson染色模型組肝纖維化評分明顯高于對照組（P＜0．01）；TGP 50、100、200 mg／kg給藥組評分明顯低于模型組（P＜0．01）。免疫組化顯示模型組肝組織巨噬細胞浸潤明顯增加，各給藥組均能抑制糖尿病肝組織巨噬細胞浸潤的增加。Western blot顯示糖尿病模型組肝組織GRP78、p-Perk及p-Eif2α表達明顯高于對照組，TGP給藥組肝組織GRP78、p-Perk及p-Eif2α表達明顯低于模型組。結論TGP對糖尿病肝損害有明顯保護作用，其機制可能與其抗炎、抑制ERS有關。

關鍵詞糖尿病；肝臟；內質網應激；炎癥；白芍總苷

高血糖肝臟損傷已成為非酒精性脂肪肝主要病因之一［1－2］。研究［3］表明巨噬細胞介導的炎癥在糖尿病肝損傷中起重要作用。內質網應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是內質網未折疊蛋白反應（unfolded protein response，UPR）持續存在或超過ERS能力時的一種病理生理狀態，近年研究［4－5］表明ERS可誘導炎癥。白芍總苷（total glucosides of paeony，TGP）是我國傳統中藥白芍根中的提取成分，其藥理作用有抗炎、抗氧化與免疫調節活性［6］。研究［7－8］表明TGP對糖尿病大鼠腎臟有明顯保護作用，但對糖尿病肝臟的影響尚未見報道。該研究進一步從ERS角度探討TGP對糖尿病肝臟保護作用機制。

1　材料與方法

1．1材料

1．1．1動物

雄性SD大鼠，體重280～300 g，安徽醫科大學實驗動物中心提供。在恒溫22℃、相對濕度65%～70%、12 h光照／12 h黑暗環境中適應飼養1周后實驗。

1．1．2藥品與試劑

TGP由安徽醫科大學臨床藥理研究所魏偉教授惠贈，用前溶于質量濃度為10 g／L的羧甲基纖維素鈉溶液中；鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）購自美國Sigma公司，臨用前溶解于0．01 mmol／L枸椽酸緩沖液中，pH＝4．5；兔抗GRP78、p-Perk、p-Eif2α多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；小鼠抗大鼠ED-1單克隆抗體購自美國Millipore公司；辣根酶標記山羊抗兔IgG購自武漢博士德公司；硝酸纖維膜購自美國Amersham公司；ECL發光試劑購自美國Pierce公司；即用型二步法免疫組化檢測試劑盒（PV-9000）、DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司；游離脂肪酸（free fatty acid，FFA）試劑盒購自南京建成生物工程公司；三酰甘油（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）試劑盒購自溫州津瑪生物科技公司。

1．2方法

1．2．1建立大鼠糖尿病模型

腹腔一次性注射STZ 60 mg／kg，48～72 h后測尾靜脈血血糖＞16．7 mmol／L以上確定為糖尿病模型，對照組僅注射等量枸緣酸緩沖液。

1．2．2動物分組及處理

設對照組、模型組、TGP給藥組（50、100、200 mg／kg灌胃）。每組10只。對照組、模型組給予等量溶媒。所有大鼠在整個實驗期間喂標準飲食，自由飲水，不應用胰島素。

1．2．3標本收集

觀察8周后收集標本。大鼠空腹16 h后，在3%、0．1 ml／100 g體重劑量的戊巴比妥腹腔注射麻醉下行右側頸總動脈插管收集血標本，4℃、1 500 r／mim離心15 min，取血漿保存在－20℃待測血糖（blood glucose，BG）、TC、TG水平。通過右側頸總動脈插管注入4℃預冷的生理鹽

2015－05－25接收

1．2．4肝組織TC、TG及FFA含量測定

按試劑盒說明書進行。

1．2．5肝組織冰凍切片油紅O染色

冰凍切片8μm水洗后置入密封容器盛裝的脂肪染色劑內（稀釋的油紅染液染色）10～15 min；用60%乙醇溶液浸泡切片至細胞質為紅色，底色呈白色為止；水洗；Harris蘇木精淡染30 s；用1%磷酸氫二鈉沖洗至變藍；用塑料吸管附貼于載玻片上，稍干后甘油明膠封固。脂肪呈紅色，胞核呈藍色。

1．2．6肝臟病理學觀察及評分標準

肝組織油紅O染色脂肪沉積及Masson染色纖維化程度判定參照文獻［9］。

1．2．7肝組織ED-1免疫組化

石蠟切片常規脫蠟，加入3%H2O2的甲醇封閉內源性過氧化酶；予微波爐暴露抗原，將切片浸入0．01 mmol／L枸櫞鹽緩沖液（pH＝6．0）；加小鼠抗大鼠ED－1單克隆抗體（1∶50）4℃過夜。漂洗后滴加生物素化山羊抗小鼠 IgG（1∶200），漂洗后，滴加PV-9000。室溫下滴加DAB顯色液。水洗終止，Harris蘇木精復染1 ～5 min，脫水后二甲苯透明，中性樹脂封片。實驗均采用刪除第一抗體作內陰性對照。陽性物質呈棕色顆粒狀，ED-1陽性結果判斷參照文獻［10］。

1．2．8Western blot法檢測肝組織GRP78、p-Perk、p-Eif2α表達

將取出的100 mg肝組織放置于冰上，加入適量裂解液超聲勻漿，4℃、12 000 r／mim離心30 min取上清液測蛋白濃度。取30 mg蛋白煮沸5min后，經6%～15%SDS-PAGE電泳，電轉移至NC膜上，在5%脫脂奶粉-PBST溶液4℃封閉過夜，洗膜后加入免抗大鼠GRP78（1∶200）、p-Perk（1∶200）、p-Eif2α（1∶200）和β-actin（1∶500），4℃過夜，然后用HRP標記的二抗（1∶2 000）雜交，37℃、1 h。在暗室中加ECL發光試劑，X線片曝光1～2 min后顯影、定影。雜交信號在圖象分析系統中進行光密度掃描。應用β-actin作為蛋白上樣量參照，其余組與其相比得到相對量，取均值。

1．3統計學處理

2　結果

表1　TGP對糖尿病大鼠體重、肝重、血糖及血脂的影響（n＝10，±s）

表1　TGP對糖尿病大鼠體重、肝重、血糖及血脂的影響（n＝10，±s）

與對照組比較：*P＜0．05，**P＜0．01；與模型組比較：＃P＜0．05

組別　　劑量（mg／kg）體重（g）肝重（g／100 g體重）BG （mmol／L）血TC （mmol／L）血TG （mmol／L）對照　　－　458±27．47　4．25±0．36　6．94±1．64　1．11±0．08　1．16±0．15模型　　－　271．75±16．86**　6．88±0．58**　31．97±4．19**　1．24±0．19*　1．70±0．16*TGP給藥　50　281．75±25．01　5．12±0．42＃　30．62±4．35　1．22±0．12　1．68±0．13 100　266．4±27．87　4．68±0．36＃　32．05±4．24　1．19±0．13　1．64±0．14 200　318．0±17．8　4．56±0．40＃27．20±4．25　1．20±0．13　1．81±0．18

2.1TGP對糖尿病大鼠體重、肝重、血糖及血脂的影響

模型組體重明顯低于對照組，模型組血糖、TC、TG及肝重明顯高于對照組；TGP給藥組體重、血糖及TC、TG水平無明顯影響，可降低糖尿病肝重的增加。見表1。

2.2TGP對糖尿病大鼠肝組織TC、TG及FFA的影響

模型組肝組織TC、TG及FFA明顯高于對照組，TGP給藥組肝組織TC、TG及FFA低于模型組。見表2。

2.3TGP對糖尿病大鼠肝組織病理學影響

肝組織油紅O染色可見肝細胞質中脂肪沉積，模型組肝細胞油紅O染色評分明顯高于對照組（2．67±0．86 vs0．42±0．16，P＜0．01）；各TGP給藥組評分明顯低于模型組（1．13±0．78、1．08±0．67、0．88±0．64 vs2．67±0．86，F＝13．12，P＜0．01）。見圖1。Masson染色模型組大鼠纖維化評分明顯高于對照組（1．86±0．64 vs 0．46±0．34，P＜0．01）；TGP 50、100、200 mg／kg給藥組評分明顯低于模型組（1．28 ±0．52、1．16±0．37、0．86±0．56 vs 1．86±0．64，F ＝6．45，P＜0．01）。見圖2。

2.4TGP對糖尿病大鼠肝組織巨噬細胞浸潤的影響

模型組肝組織ED-1表達明顯高于對照組（2．64±0．86 vs 0．62±0．44，P＜0．01）；TGP 50、100、200 mg／kg給藥組肝組織ED-1表達明顯低于模型組（1．64±0．42、1．32±0．44、0．86±0．48 vs 2．64±0．86，F＝8．67，P＜0．01），模型組肝組織浸潤的巨噬細胞體積較大，TGP給藥后浸潤的巨噬細胞體積較小。見圖3。

表2　TGP對糖尿病大鼠肝組織TC、TG及FFA的影響（n＝10，±s）

表2　TGP對糖尿病大鼠肝組織TC、TG及FFA的影響（n＝10，±s）

與對照組比較：**P＜0．01；與模型組比較：＃P＜0．05

組別　　劑量（mg／kg）TG （mg／g）TC （mg／g）FFA （mg／g）－　7．10±0．46　7．45±0．42　1．32±0．16模型　　－　11．36±0．76**　9．48±0．88**　2．76±0．34**TGP給藥　50　8．20±0．58＃　8．32±0．68＃　1．86±0．15＃100　7．78±0．52＃　7．79±0．65＃　1．74±0．16＃200　7．49±0．56＃　7．64±0．73＃　1．65±0．18對照＃

2.5TGP對糖尿病大鼠肝組織GRP78、p-Perk及p-Eif2α表達的影響

Western blot法顯示模型組肝組織GRP78、p-Perk及p-Eif2α蛋白表達明顯高于對照組（P＜0．01），TGP 50、100、200 mg／kg給藥后肝組織GRP78、p-Perk及p-Eif2α蛋白表達明顯低于模型組（P＜0．05，P＜0．01）。見圖4～6。

3　討論

目前國內外對糖尿病性脂肪肝（diabetic faty liver，DFL）干預作用的研究尚少，近年來，研究［11－13］表明TGP對化學性、酒精性和非酒精性、免疫性、藥源性、生物性的多種肝損傷模型顯示保護效應，但TGP對DFL保護作用尚未見報道。本研究表明TGP可降低糖尿病肝組織TC、TG及FFA水平，改善肝組織病理損害及脂肪浸潤，并明顯降低肝組織巨噬細胞浸潤；TGP給藥組巨噬細胞體積偏小，提示TGP可能抑制糖尿病肝組織巨噬細胞激活。

肝細胞代謝功能活躍，擁有數量豐富的內質網，內質網的功能紊亂勢必對肝細胞功能造成影響進而導致疾病產生。非酒精性脂肪肝的發病過程中，大量的FFA在肝細胞內聚集，誘導肝細胞發生脂質過氧化，最后凋亡壞死，強烈的脂質過氧化是ERS的誘發因素。在高飽和脂肪酸喂養的Wistar大鼠發生肝脂肪變性后，ERS標志蛋白CHOP、GRP78、XBP-1表達增加，Caspase3蛋白活性增強［14］；在去除ERS通路中的ATF6α、eIF2α、IRE1α的小鼠表現為ERS失調，肝細胞脂肪變性，ERS蛋白合成恢復后，通過UPR通路活化作用，預防調節脂質代謝的代謝轉錄因子的產生，提示ERS可能是引起脂肪肝的基礎［15－16］。

研究［4］表明ERS是代謝性炎癥主要啟動因素，如肥胖、胰島素抵抗、2型糖尿病等啟動ERS，導致ERS的3條UPR通路被激活，UPR與炎癥信號轉導通路之間通過各種機制存在相互聯系，包括核因子-κB和分裂原活化蛋白激酶的JUN N-末端激酶、ROS及內質網鈣釋放等。本研究表明糖尿病肝組織ERS相關蛋白GRP78、p-Perk及p-Eif2α蛋白表達明顯增加，同時炎癥巨噬細胞浸潤也明顯增多，提示ERS可能參與糖尿病肝損害過程中脂肪肝的發生及炎癥機制的產生，TGP給藥組肝組織GRP78、p-Perk及p-Eif2α蛋白表達明顯降低，提示TGP可能通過抑制ERS對糖尿病肝組織發揮保護作用，但其詳細機制尚需進一步研究。

綜上所述，TGP對糖尿病肝損害有明顯保護作用，其機制與抗炎、抑制ERS可能有關。

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中圖分類號R 587．1；R 364．5

文獻標志碼A

文章編號1000－1492（2015）10－1451－05

基金項目：安徽省自然科學基金（編號：1208085MH149）

作者單位：安徽醫科大學第一附屬醫院感染病科，合肥230022

作者簡介：夏玲鈴，副教授，碩士生導師，責任作者，E-mail：wuyonggui ＠medmail．com．cn水反復灌洗肝臟，至整個肝臟顏色變蒼白后游離，置于冰上，取部分肝組織待測TC、TG及FFA含量，取8 mm×8 mm大小肝組織置于10%中性甲醛溶液中固定，石蠟包埋后制成厚度為3μm的切片，行Masson染色。同時制4μm厚多聚賴氨酸處理切片，免疫組化檢測。另取8 mm×8 mm大小肝組織 OCT包埋后制成8μm冰凍切片，油紅O染色，剩余組織迅速放入－80℃冰箱待測。

Effect of total glucosides of paeony on endoplasm ic reticulum stress in streptozotocin-induced diabetic rats

Xia Lingling，Zhou Zhongsong，Xie Qinxiu，et al
（Dept of Infectious Diseases，The First Affiliated Hospital of AnhuiMedical University，Hefei230022）

AbstractObjectiveTo investigate prevention of early liver injury by total glucosides of paeony（TGP）in diabetic rats and whether itsmechanism was related to the inhibition of endoplasmic reticulum stress．MethodsTGP（50，100，200 mg／kg）was orally administered once a day for 8 weeks in STZ-induced diabetic rats．The levels of cholesterol，triglyceride and free fatty acid in liver tissue were determined by spetrophotometric method．Liver lesions were evaluated using oil red O and Masson staining．Expression of ED-1 was determined by immunohistochemistry and GRP78，p-Perk，p-Eif2αwere determined by Western blot analysis．ResultsTGP treatment in all three doses significantly reduced increased liver weight and liver lipid content in diabetic rats．Oil red O staining score in diabetic group was significantly higher than that in the control group（P＜0．01），TGP 50，100，200 mg／kg treatment group scoreswere significantly lower than those in the diabetic group（P＜0．01）．Masson staining showed hepatic fibrosis score wasmuch higher than that in the control group（P＜0．01），hepatic fibrosis scores in TGP 50，100，200 mg／kg treatment group were significantly lower than those in the diabetic group．Compared with the control group，immunohistochemistry showed thatmacrophage infiltration in the liver tissue from diabetic significantly increased，which was inhibited by TGP treatment in all three doses．Expressions of GRP78，p-Perk and p-Eif2αdetermined by Western blot in liver tissue of diabetic group were significantly higher than that in the control group，which also were decreased by TGP administration（50，100，200 mg／kg）．ConclusionOur results indicate that TGP has potential as a treatment for diabetic liver injury through attenuating liver lipid accumulation and inflammation as well as ERS induced by diabetic condition．

Key wordsdiabetes；liver；endoplasmic reticulum stress；inflammation；total glucosides of paeony