LCE3C在皮膚癌組織中分布和細胞定位及其調(diào)控機制的初步研究

陳瓊瓊，涂珍珍，王　瑞，張思平，趙　盼，成　芳，查曉軍，周海勝

LCE3C在皮膚癌組織中分布和細胞定位及其調(diào)控機制的初步研究

陳瓊瓊1，涂珍珍1，王瑞1，張思平2，趙盼1，成芳1，查曉軍1，周海勝1

摘要目的研究LCE3C蛋白在皮膚鱗狀細胞癌（SCC）以及基底細胞癌（BCC）中的分布及其調(diào)控的分子機制。方法

免疫組織化學(xué)法檢測LCE3C在SCC和BCC組織中的表達。構(gòu)建綠色熒光蛋白融合表達的LCE3C重組表達載體pLCE3C-GFP，轉(zhuǎn)染人SCC細胞系A(chǔ)431，采用激光共聚焦顯微鏡分析LCE3C在A431細胞中的定位。Western blot法檢測轉(zhuǎn)錄因子GRHL3對LCE3C表達的影響。結(jié)果免疫組化結(jié)果顯示，與正常皮膚組織比較，LCE3C在SCC和BCC組織中表達明顯增加；在皮膚癌組織中LCE3C主要分布在表皮的角質(zhì)層。激光共聚焦結(jié)果顯示，LCE3C主要分布在細胞外基質(zhì)（ECM）中；Western blot結(jié)果顯示，與角質(zhì)形成細胞（HaCaT）比較，A431細胞中GRHL3表達量顯著降低，而LCE3C表達量明顯增高；過量表達GRHL3的細胞（A431／GRHL3）LCE3C表達量顯著降低。結(jié)論與正常皮膚組織比較，LCE3C在皮膚癌中的表達增加，主要分布在皮膚角質(zhì)層的ECM；轉(zhuǎn)錄因子GRHL3與皮膚癌組織LCE3C的表達呈負相關(guān)性。

關(guān)鍵詞LCE3C；皮膚鱗狀細胞癌；基底細胞癌；細胞定位

全基因組關(guān)聯(lián)分析研究［1］顯示位于人染色體1q21區(qū)域中的晚期角質(zhì)化包膜蛋白（late cornified envelope，LCE）基因與中國漢族人的銀屑病易感性明確相關(guān)。LCE基因的主要功能是參與皮膚角化層的構(gòu)成。功能研究［2］顯示LCE3C基因的缺失是誘發(fā)銀屑病的危險因素。皮膚癌是一種常見的皮膚腫瘤，如皮膚鱗狀細胞癌（squamous cell carcinoma，SCC）和基底細胞癌（basal cell carcinoma，BCC），角質(zhì)形成細胞的過度增殖和異常分化等與銀屑病有相似特點。關(guān)于LCE3C在皮膚癌中的表達水平及其調(diào)控表達的分子機制鮮有報道。GRHL3作為一種轉(zhuǎn)錄因子，在胚胎發(fā)育過程中參與上皮細胞遷移，與神經(jīng)管閉合有關(guān)［3］，而且參與成人表皮劃痕的損傷修復(fù)［4］。在表皮的正常分化過程中，基底層細胞會由先前的未分化狀態(tài)逐漸發(fā)展成熟，GRHL3在這一過程中可以促進表皮基底層細胞特異性基因的表達［5］。該研究通過觀察LCE3C在皮膚癌的表達變化及其細胞分布，初步探討GRHL3是否參與調(diào)控LCE3C表達，進一步探討LCE3C在皮膚癌的發(fā)病過程中作用及其分子機制。

1　材料與方法

1．1材料

1．1．1組織標本、細胞系與載體

人皮膚癌組織標本由安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院病理科提供，其中SCC和BCC組織標本各12例；正常皮膚組織標本5例，均取自安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院泌尿外科門診包皮環(huán)切手術(shù)患者；人SCC細胞株A431和人永生化角質(zhì)形成層細胞株HaCaT由安徽醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室實驗室凍存；過量表達GRHL3的A431細胞（A431／GRHL3）由本實驗室建立；pEGFP N1載體由本實驗室凍存；人LCE3C cDNA的質(zhì)粒由廈門大學(xué)韓家淮教授惠贈。

1．1．2培養(yǎng)基及試劑

高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、青霉素／鏈霉素（P／S）均購自美國Hyclone公司；Lip2000（LipofectaminTM2000）購自美國Invitrogen公司；G418、DAPI染色液均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Top 10感受態(tài)細胞、質(zhì)粒小提試劑盒均購自北京天根生化科技有限公司；DL 2 000 DNA Marker、DL 15 000 DNA Marker、NheⅠ、XhoⅠ、T4 DNA連接酶和SYBR?Premix Ex TaqTM均購自日本TaKaRa公司；通用型SP檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；蛋白Marker、超敏SuperSignal?West Pico均購自美國Thermo Fisher Scientific公司；PVDF膜購自美國Millipore公司；兔源抗LCE3C、鼠源抗GAPDH均購自美國Abcam公司；兔源抗GRHL3、羊抗兔IgG-HRP、羊抗鼠IgGHRP均購自美國Santa Cruz公司。

1．2方法

1．2．1免疫組化

組織切片（4μm）常規(guī)脫蠟入水

2015－05－25接收

230032

2安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院皮膚科，合肥230001

1．2．2載體構(gòu)建

按1∶150的比例擴增含LCE3C cDNA的質(zhì)粒菌液，培養(yǎng)過夜后提取質(zhì)粒；根據(jù)Gen-Bank提供的人LCE3C基因mRNA的序列（GenBank序列號：NM＿178434．2），利用Primer 5．0軟件，設(shè)計引物（上游引物：5′-CTAGCTAGCTATGTCCTGCCAGCAAAAC-3′，下游引物：5′-CCGCTCGAGCGG GCAGCAGCCCCCAGAGC-3′），在上游和下游引物的5′末端分別引入內(nèi)切酶NheⅠ和XhoⅠ的識別序列。PCR擴增目的片段，1%瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收目的片段，用T4 DNA連接酶連接LCE3C目的片段和pEGFPN1載體，然后轉(zhuǎn)化到Top 10中，平板克隆后挑取菌落擴大培養(yǎng)，PCR鑒定，提取質(zhì)粒，經(jīng)NheⅠ、XhoⅠ雙酶切后，選取目的片段大小一致的克隆，送上海生工生物工程股份有限公司測序。

1．2．3構(gòu)建細胞系

將重組表達載體pLCE3C-綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）用脂質(zhì)體Lip2000轉(zhuǎn)染到A431細胞中，轉(zhuǎn)染2 d后，可見部分細胞有綠色熒光，改用含400μg／ml G418的DMEM培養(yǎng)基篩選細胞；篩選1個月后，換用含有1%P／S、10%FBS的高糖DMEM繼續(xù)培養(yǎng)，凍存。1．2．4激光共聚焦實驗

按一定的比例將A431細胞傳至鋪有無菌玻璃片的12孔板，使細胞可以在第2天融合至70%～80%，轉(zhuǎn)染前將細胞饑餓處理6～8 h；按照Lip2000說明書分別向2孔細胞瞬時轉(zhuǎn)染pLCE3C-GFP和pEGFP N1做對照；48 h后，熒光顯微鏡（XDS-3FL，意大利Optika公司）下觀察到大部分細胞有熒光，PBS洗3遍，4%多聚甲醛固定，DAPI染核，最后取出板底的玻璃片，倒扣在載玻片上，激光共聚焦顯微鏡（SPS-DMI6000-DIC，德國徠卡公司）觀察、拍片。

1．2．5Western blot法檢測

收集細胞總蛋白，制備SDS-PAGE凝膠，上樣后電泳，待目的蛋白充分分離至不同位置后移至PVDF膜上，室溫封閉45 min，4℃過夜孵育一抗LCE3C（1∶1 000）。次日PBST洗滌3次，室溫HRP標記的二抗6～8 h，TBST洗滌后，加入超敏，暗室中X線片曝光，最后用Image J軟件對目的條帶進行灰度分析。

1．3統(tǒng)計學(xué)處理

2　結(jié)果

2.1免疫組化檢測LCE3C在SCC和BCC組織中的分布及表達

免疫組化結(jié)果顯示，正常皮膚組織表皮層僅少量著色，表皮各層之間著色差異無統(tǒng)計學(xué)意義；而SCC和BCC患者皮膚組織表皮層著色顯著，但細胞鮮少著色，棕黃色沉淀主要集中在細胞外基質(zhì)（extracellular matrixc，ECM），同時LCE3C在表皮各層之間的分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義，相比基底層、棘層、顆粒層、表皮的最外層，即角質(zhì)層著色最深，提示皮膚癌組織表皮層LCE3C表達明顯增加，主要分布在角質(zhì)層。其中12例SCC的IOD值（29．775±1．630）和12例BCC的IOD值（49．076± 1．594）均為陽性，與5例正常皮膚組織的IOD值（15．859±0．975）比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）。見圖1。

2.2構(gòu)建pLCE3C-GFP載體及鑒定

為進一步觀察LCE3C在細胞定位，擬構(gòu)建GFP融合表達載體。重組菌的PCR檢測結(jié)果顯示擴增出的目的片段約為280 bp。見圖2A。重組載體經(jīng)NheⅠ、XhoⅠ雙酶切出現(xiàn)2個DNA片段，經(jīng)過DL 15 000 DNA Marker比對，和pEGFP N1（4 700 bp）、目的片段LCE3C（285 bp）條帶位置一致，重組載體送上海生工測序，序列與GenBank序列一致，證明載體構(gòu)建成功。見圖2B、2C。

2.3A431／LCE3C-GFP細胞系的構(gòu)建

將A431細胞利用脂質(zhì)體分別轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pLCE3C-GFP和對照質(zhì)粒pEGFPN1，轉(zhuǎn)染24 h后，熒光顯微鏡下可觀察到A431細胞，細胞輪廓清晰，熒光較強。通過G418篩選，得到單個細胞克隆。見圖3。

2.4激光共聚焦顯微鏡實驗檢測LCE3C在A431／LCE3C-GFP細胞中的定位

激光共聚焦結(jié)果顯示，對照組A431／GFP細胞綠色熒光分布于整個細胞。而在A431／LCE3C-GFP的細胞中，融合表達的LCE3C-GFP蛋白主要定位于ECM中。見圖4。

2.5W estern b lot法檢測LCE3C、GRHL3在HaCaT、A431、A431／GRHL3細胞中的表達

為探討轉(zhuǎn)錄因子GRHL3在皮膚癌細胞中是否參與調(diào)控LCE3C基因的表達，擬利用實驗室已經(jīng)建立的過量表達GRHL3的細胞株，通過Western blot法分析GRHL3對LCE3C表達的影響。與HaCaT細胞比較，A431細胞中GRHL3表達量明顯降低，與A431細胞比較，A431／GRHL3細胞中GRHL3表達量明顯升高（F＝37．602，P＜0．05）；與HaCaT細胞比較，A431細胞中LCE3C表達量明顯升高，與A431細胞比較，A431／GRHL3細胞中LCE3C表達量顯著降低（F＝45．109，P＜0．05）。見圖5。

3　討論

SCC和BCC是一類非黑色素瘤皮膚癌，多發(fā)于頭部、頸部、子宮以及肺部［6－7］，SCC和BCC在表皮分化的過程中會出現(xiàn)過度增殖與角化不完全的現(xiàn)象，類似于銀屑病局部病理特征。LCE基因是位于人類1號染色體長臂近端的一個具有表皮分化復(fù)合物功能區(qū)的基因家族［8］。在表皮細胞分化的過程中這一功能區(qū)的基因均表達，如兜甲蛋白、外皮蛋白、絲聚合蛋白、富含脯氨酸的小分子量蛋白以及LCE［9－10］。根據(jù)氨基酸序列、基因結(jié)構(gòu)以及表達方式的不同，可以將LCE家族分為LCE1～LCE6等6組，共18個成員。研究［11］表明銀屑病組織標本的皮損部位LCE3表達升高；當正常皮膚發(fā)生表皮損傷時，LCE3表達增加［12］。在皮膚癌組織學(xué)方面，本研究顯示，LCE3C在SCC和BCC組織中的表達量明顯高于正常組織，主要分布在表皮的角質(zhì)層；在細胞定位方面，本研究顯示LCE3C主要分布于ECM；與HaCaT比較，LCE3C在人鱗癌細胞系A(chǔ)431中的表達也是明顯增高，這和皮膚癌的免疫組化結(jié)果一致，提示LCE3C表達增加可能參與SCC和BCC的發(fā)生過程。LCE3C作為ECM的一種分泌蛋白，促進表皮損傷修復(fù)而協(xié)同參與形成表皮屏障。皮膚癌大都具有較強的局部侵襲能力，這種侵襲作用可能作為一種破壞表皮屏障的誘發(fā)因素，誘導(dǎo)LCE3C的表達以促進表皮的創(chuàng)傷修復(fù)。

GRH家族最早被發(fā)現(xiàn)參與調(diào)控果蠅上皮發(fā)育的過程，其中轉(zhuǎn)錄因子GRHL3是GRH家族的成員之一，在哺乳動物胚胎發(fā)育過程中，參與上皮細胞的遷移；而在成人表皮損傷后，GRHL3參與調(diào)控表皮的損傷修復(fù)過程［13］。Darido et al［14］證實GHRL3－／－小鼠在受到二甲基苯并蒽或佛波酯刺激后，較野生型小鼠更易發(fā)生皮膚癌。前期研究［15］顯示，已經(jīng)成功構(gòu)建了腎小管上皮間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)分化模型；通過過量表達GRHL3可以誘導(dǎo)上皮－間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)分化，從而促進腫瘤的局部侵襲和遠處轉(zhuǎn)移；同時，Guardiola-Serrano etal［16］也在人乳腺癌細胞系中證實腫瘤壞死因子促進GRHL3的表達，并參與調(diào)控腫瘤細胞的遷移。這些研究提示GRHL3可能參與調(diào)控LCE3C的表達。細胞水平研究顯示GRHL3在人SCC細胞系A(chǔ)431中的表達水平較HaCaT明顯下降，同時LCE3C的表達增加；相反，在A431／GRHL3細胞系中，LCE3C的表達顯著降低。這些結(jié)果提示LCE3C的表達可能與GRHL3的負調(diào)控有關(guān)，但其調(diào)控的分子機制有待進一步研究。

LCE3C作為皮膚表皮分化復(fù)合物的成分之一，分布于皮膚角質(zhì)層的表皮ECM，參與表皮損傷的修復(fù)和表皮屏障的形成。在SCC、BCC等潛在的侵襲作用而導(dǎo)致表皮的局部損傷，可能誘發(fā)LCE3C的表達增加以促進局部損傷修復(fù)；LCE3C的表達改變可能受到轉(zhuǎn)錄因子GRHL3的負調(diào)控；這將為后續(xù)研究LCE3C在皮膚癌中的作用及其調(diào)控分子機制奠定基礎(chǔ)。

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中圖分類號R 319；R 758．69

文獻標志碼A

文章編號1000－1492（2015）10－1413－05

基金項目：國家自然科學(xué)基金（編號：81172591）

作者單位：1安徽醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，合肥

作者簡介：陳瓊瓊，女，碩士研究生；周海勝，男，副教授，碩士生導(dǎo)師，責任作者，E-mail：haishengs＠ahmu．edu．cn后，微波熱修復(fù)抗原，用3%H2O2除去內(nèi)源性過氧化物酶，山羊血清封閉，4℃孵育一抗LCE3C （1∶100）過夜。第2天依次室溫孵育生物素化通用二抗工作液、辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，最后組織經(jīng)脫水透明后烘干封片。在400倍下，每張切片取3個視野拍照，并用Image pro plus 6．0圖像分析系統(tǒng)測定圖像中陽性反應(yīng)部位的積分光密度（integral optical density，IOD）值。

The LCE3C expression in human skin cancers and the potential regulation m echanism s

Chen Qiongqiong，Tu Zhenzhen，Wang Rui，et al
（Dept of Biochemistry and Molecular Biology，Anhui Medical University，Hefei230032）

AbstractObjectiveTo investigate the LCE3C expresson in squamous cell carcinoma（SCC）and basal cell carcinoma（BCC），and the potentialmechanisms for regulating LCE3C expression．MethodsImmunohistochemical method was performed to detect the expression levels of LCE3C in the normal skin tissues or the lesion skin tissues from patientswith SCC and BCC．To find the cellular localization of the LCE3C proteins，human skin cancer cells were transfected by recombinant plasmid（pLCE3C-GFP）containing human LCE3C cDNA fused with the GFP，and then were observed under the confocal laser scanning microscopy．To further investigate the potentialmechanisms for regulating LCE3C expression in skin cancer，Western blot was used to detect the expression levels of GRHL3 and LCE3C in the skin cancer cells．ResultsImmunohistochemical analysis showed that the LCE3C highly expressed at the stratum corneum in the lesion skin tissues from patients with SCC and BCC，compared with the normal skin tissues．LCE3C proteins fused with GFP in A431 cells were mainly observed in extracellular matrix （ECM）based on the confocal laser scanning．Western blot analysis showed that the expression level of GRHL3 in the A431 cellswas reduced than that of the HaCaT cells；on the contrary，the expression level of LCE3C significantly increased in the A431 cells．Furthermore，LCE3C expression was also significantly decreased in the GRHL3 over-expressed cell（A431／GRHL3）compared with the A431 cells．ConclusionCompared to the normal skin tissues，LCE3C is dramatically expressed at the corneous layers in the skin cancer tissues．LCE3C proteins aremainly expressed in ECM，and might be negatively regulated by GRHL3 in A431 cells．

Key wordsLCE3C；squamous cell carcinoma；basal cell carcinoma；cellular localization