前列腺素E1預處理對大鼠SMA急性缺血再灌注損傷保護的研究

曹志新，劉　斌，趙德銀

前列腺素E1預處理對大鼠SMA急性缺血再灌注損傷保護的研究

曹志新，劉斌，趙德銀

摘要目的研究前列腺素E1（PGE1）預處理在大鼠腸系膜上動脈（SMA）急性缺血再灌注損傷（IRI）中對小腸細胞的保護作用。方法18只健康雄性SD大鼠隨機平均分為對照組、假手術組、實驗組。采用夾閉SMA 1 h再灌注2 h的方法建立大鼠急性腸IRI模型，對照組僅暴露SMA。假手術組標準建模。實驗組于再灌注前從尾靜脈注入20μg／kg的PGE1。光鏡下觀察小腸變化并采用Chiu氏6級評分法評分。腸管黏膜細胞進行HE檢查，并檢測相關凋亡蛋白Bax、B淋巴細胞瘤-2基因（Bcl-2）的表達，同時檢測血清中腸脂肪酸結合蛋白（IFABP）、二胺氧化酶（DAO）的變化。結果HE檢測顯示對照組鏡下未見明顯變化；假手術組絨毛上皮粘膜缺失、破潰并出血壞死；實驗組腸粘膜損傷較輕，壞死、脫落少見，與假手術組比較，實驗組Chiu氏評分明顯低于假手術組。假手術組、實驗組Bax、Bcl-2表達均高于對照組（P＜0．05），實驗組表達明顯低于假手術組（P＜0．05）。假手術組、實驗組血清IFABP、DAO含量均高于對照組（P＜0．05），實驗組血清IFABP含量低于假手術組（P＜0．05）。結論PGE1能減輕大鼠SMA急性IRI所致小腸的壞死程度，保護受損的小腸黏膜。

關鍵詞腸系膜上動脈；急性缺血；缺血再灌注損傷；前列腺素E1

腸道缺血再灌注損傷（ischemical reperfusion injury，IRI）是指嚴重的腸道動脈缺血一定時間后，血供恢復造成組織損傷加重的一種現象。急性腸系膜上動脈（superiormesenteric artery，SMA）栓塞患者是外科急重癥之一，手術死亡率達60%～85%，與小腸IRI密切相關［1］。IRI中腸黏膜腸絨毛頂部是對缺血低氧最敏感、最易損傷的部位［2］。該實驗通過建立大鼠SMA急性IRI模型，予以前列腺素E1 （prostaglandin E1，PGE1）預處理，從小腸黏膜病理學，細胞凋亡及血清中大鼠腸脂肪酸結合蛋白（intestinal fatty acid binding protein，IFABP）和二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）不同方面比較，研究PGE1對SMA急性缺血后對小腸IRI損傷的保護作用。

1　材料與方法

1．1主要藥物、試劑與儀器

PGE1規格10μg：2 m l，購自北京泰德制藥有限公司；DAB顯色試劑盒、Bax一抗、B淋巴細胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2，

2015－05－22接收

1．2實驗動物

18只健康雄性SD大鼠，SPF級，體重350～420 g，購自安徽醫科大學實驗動物中心。術前標準環境適應飼養1周。

1．3方法

1．3．1分組與模型制備

18只健康雄性SD大鼠隨機分為對照組、假手術組、實驗組，每組6只。所有大鼠術前禁食12 h，自由飲水。10%水合氯醛（0．3 ml／100 mg）腹腔注射麻醉，麻醉滿意后，備皮固定于手術臺。術野消毒鋪巾，取上腹部正中切口逐層進腹，顯露SMA。采取扎閉腸系膜上動脈1 h再灌注2 h的方法建模［3］，對照組僅顯露 SMA，術畢直接取材；假手術組標準建模；實驗組于再灌注前從尾靜脈注入20μg／kg PGE1，余同假手術組。嚴格無菌操作。SMA夾閉期間，間斷向腹腔內注射約15 ～20 ml／kg生理鹽水，預防再灌注時出現一過性低血容量反應。關腹后再向腹腔內追加25～30 m l／kg生理鹽水（含32萬U慶大霉素／L）用以擴容及預防可能的腹腔感染。術畢再灌注2 h取標本及抽血。

1．3．2免疫組化（SABC）法檢測

采用SABC三步法測定每組、各時間點腸管Bax、Bcl-2的水平表達，操作嚴格按照試劑盒說明進行。并用細胞內有明顯黃色／棕黃色顆粒判定為陽性對照。每組隨機選取6張切片，400倍不連續視野下任意選取3個視野進行圖像分析。采用Image Pro Plus6．0圖像分析軟件測定Bax和Bcl-2的吸光度（optical density，OD）值，以平均OD值做為Bax和Bcl-2的測量值。

1．3．3病理形態學觀察

每組大鼠切取病變腸管回腸段約4 cm，腸腔清洗后用10%福爾馬林固定。脫水，石蠟覆蓋，制作切片。常規HE染色，于40倍顯微鏡下觀察腸管的形態學、病理學變化。并進行Chiu氏評分。0分：正常小腸粘膜絨毛；1分：上皮下間隙增大，通常在小腸絨毛的頂端，伴有毛細血管淤血；2分：上皮下間隙擴張，伴有上皮層和固有層的中度分離；3分：絨毛兩側上皮層和固有層大量分離，部分絨毛頂端破損；4分：絨毛破損伴有固有層毛細血管暴露，部分固有層的細胞成分增多；5分：固有層破壞及不完整，出血及潰瘍。

1．3．4血清DAO及IFABP測定

于再灌注2 h后抽取大鼠血液樣本，所有血液樣本以3000 r／min離心10 min，取上清液。嚴格按照試劑盒說明操作。

1．4統計學處理采用SPSS 17．0軟件進行分析，數據以±s表示。組間采用單因素方差分析。

2　結果

2．1大體觀察

對照組大鼠腸組織鮮活紅潤，小動脈搏動有力，腸蠕動正常，絨毛完整，排列整齊，無明顯出血潰瘍；假手術組夾閉1 h后腸管顏色呈暗紅色，蠕動減慢或消失，有臭味，腸管內見血性滲出，腸腔擴張、淤血，腸黏膜充血壞死；絨毛與固有層分離，絨毛破潰脫落；實驗組夾閉1 h后腸管呈灰紅色，蠕動減慢，腸管內少量血性滲出，絨毛與固有層發生分離的較少，部分形成出血及潰瘍，絨毛部分脫落，表現較假手術組明顯減輕。見圖1。

2.2Chiu氏評分的組間比較

對照組僅開腹，SMA未做任何處理，Chiu氏評分為0；假手術組正常建模，Chiu氏評分為（4．52±0．33）分；實驗組于再灌注前行PGE1預處理，Chiu氏評分為（2．62± 0．35）分。

2.3免疫組化法檢測Bax、Bcl-2的表達

各組方差分析差異有統計學意義（FBax＝377．484、FBcl-2＝212．060、FBcl-2／Bax＝121．853，P＜0．05）。再灌注2 h后與對照組比較，假手術組和實驗組腸管Bax、Bcl-2的表達呈上升趨勢，差異有統計學意義（P＜0．05）。實驗組較假手術組的表達明顯降低，有統計學意義（P＜0．05）。見表1、圖2。

表1　3組　Bax、Bcl-2及比值的表達情況（n＝6，±s）

表1　3組　Bax、Bcl-2及比值的表達情況（n＝6，±s）

與假手術組比較：*P＜0．05；與對照組比較：＃P＜0．05

組別Bax　Bcl-2　Bcl-2／Bax對照0．076±0．005　0．193±0．009　2．545±0．192假手術　0．541±0．041　0．584±0．041　1．081±0．036實驗　0．245±0．031*＃　0．347±0．039*?！?．436±0．219*＃

2.4血清IFABP及DAO含量變化

各組方差分析差異有統計學意義（FIFABP＝233．814、FDAO＝94．317，P＜0．05）。再灌注2 h后假手術組、實驗組大鼠血清IFABP、DAO較對照組顯著增加（P＜0．05），實驗組較假手術組降低（P＜0．05）。見表2。

表2　大鼠血清　IFABP及　DAO含量變化（n＝6，pg／ml，±s）

表2　大鼠血清　IFABP及　DAO含量變化（n＝6，pg／ml，±s）

與假手術組比較：*P＜0．05；與對照組比較：＃P＜0．05

組別IFABP缺血前　　再灌注2 h DAO缺血前　　再灌注2 h對照　34．707±0．495　38．593±4．610　12．482±0．695　13．951±2．678假手術　34．905±1．534　429．402±39．521?！?2．885±0．860　43．112±3．951＃實驗　40．383±1．649　301．801±38．396*＃15．052±0．819　26．163±4．260*＃

3　討論

急性SMA以SMA栓塞常見，臨床表現為嚴重的急腹癥。雖然在早期診斷和血管重建方面做了相當大的努力，各大醫學中心報告病死率仍然高達80%［1］，不僅因為本病多不能及時診斷和處理，還與IRI損傷密切相關，如何及時診斷和合適的處理是臨床亟待解決的問題之一。本實驗采用PGE1預處理研究PGE1對SMA急性缺血的保護作用。

PGE1是血管內皮細胞分泌的血管舒張劑，通過激活腺苷酸環化酶使血管平滑肌松弛，并且抑制交感神經末梢釋放去甲腎上腺素使血管擴張。另外PGE1可以抑制中性粒細胞激活和氧自由基、超氧化物產生，達到抑制減輕炎癥反應。PGE1具有改善胃腸粘膜血流量，改善胃腸急性缺血產生的副作用，保護消化道黏膜等作用［4］。

細胞凋亡是腸IRI整個病理發展過程的關鍵因素之一。通過檢測腸組織細胞凋亡相關蛋白，可以反映大鼠SMA急性缺血后腸管損傷情況。Bcl-2／Bax的比值決定著凋亡的情況［5－6］。Bcl-2蛋白表達上升，Bax表達下調，Bcl-2／Bax上升則抑制細胞凋亡。本研究顯示，假手術組、實驗組與對照組比較都呈現高表達，說明腸IRI中腸管細胞凋亡增加。腸管損傷嚴重。實驗組相對假手術組呈現低表達（P＜0．05），說明PGE1預處理的實驗組細胞凋亡較假手術組輕，PGE1預處理對小腸粘膜細胞具有保護作用。

IFABP是小腸損傷的血清標志物之一。研究［7］顯示小腸缺血性疾病患者的血清和尿液中IFABP呈明顯升高趨勢，而且和缺血嚴重程度及時間呈正相關性。本研究通過PGE1干預，檢測相同時間點血清中的IFABP濃度，假手術組和實驗組較對照組明顯升高。說明假手術組和實驗組都存在明顯的腸管缺血損傷。實驗組較假手術組降低（P＜0．05），說明PGE1干預的實驗組腸管缺血損傷程度較假手術組輕。

DAO是具有高度活性的細胞內酶，大部分位于空腸、回腸的粘膜絨毛上，正常血漿中DAO含量很低。當腸黏膜受損時DAO可以很快的進入血液循環，導致血漿中DAO含量急劇升高［8］，外周血中DAO含量能反映腸黏膜的損傷程度及腸黏膜的完整性［9］。本實驗結果顯示假手術組、實驗組血清中DAO含量均明顯高于對照組，說明均存在IRI。實驗組預先給予PGE1干預，其血清中DAO含量明顯低于假手術組（P＜0．05），表明實驗組腸IRI較假手術組減輕。

參考文獻

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［9］Nathan B P，Nisar R，Short J，et al．Delayed olfactory nerve regeneration in ApoE-deficient mice［J］．Brain Res，2005，1041 （1）：87－94．

中圖分類號R 574

文獻標志碼A

文章編號1000－1492（2015）10－1409－04

作者單位：安徽醫科大學第一附屬醫院普通外科，合肥230022

作者簡介：曹志新，男，碩士研究生；劉斌，男，副教授，副主任醫師，碩士生導師，責任作者，E-mail：13399519008＠163．comBcl-2）、鏈霉親和素生物素復合物（strept avidin-biotin complex，SABC）免疫組化染色試劑盒；DAO測定試劑盒，IFABP免疫組化檢測試劑盒均購自武漢博士德生物有限公司。

The effect of pretreatment with prostaglandin E1 on acutemesenteric ischem ia and reperfusion injury

Cao Zhixin，Liu Bin，Zhao Deyin
（Dept of General Surgery，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei230022）

AbstractObjectiveTo study the pretreatmentwith prostaglandin E1（PGE1）on acute superiormesenteric artery（SMA）ischemia reperfusion injury of intestinal cell in rats．Methods18 healthymale SD ratswere random ly divided into control group，sham operation group and experimental group．IRIof SMAmodelwasmade by clamping the SMA for one hour and two hours after reperfusion in the control group and the experimental group，respectively．PGE1（20μg／kg）was injected from the tail vein in the control group and the experimental group．Character of pathology of small intestine was examined．The expression of Bax and Bcl-2 in small intestine cells and change of IFABP and DAO in serum were detected．Resu ltsPathologic changes showed that therewas no change in the control group；while in the sham operation group，chorionic epithelium mucosa ulceration and hemorrhage and necrosis occurred more seriously than that in the experimental group．Expression of Bax and Bcl-2 was higher in the sham operation group and the experimental group than that in the control group（P＜0．05），and itwas obviously lower in the experimental group than in the sham operation group（P＜0．05）．The content of IFABP and DAO in blood serum：itwas higher in the sham operation group and the experimental group than in the control group（P＜0．05），and itwas lower in the experimental group than in the sham operation group（P＜0．05）．ConclusionPGE1 can relieve the alvine necrosis caused by rats’mesenteric reperfusion injury after acute artery ischemia and thus protect damaged mucosa of small intestine．

Key wordssuperiormesenteric artery；acute ischemia；ischemia reperfusion injury；prostaglandin E1