m icroRNA-21對(duì)裸鼠人膽管癌細(xì)胞移植瘤EMT的影響

晉志遠(yuǎn)，黃　強(qiáng)，劉臣海，劉　振，林先盛，謝　放

m icroRNA-21對(duì)裸鼠人膽管癌細(xì)胞移植瘤EMT的影響

晉志遠(yuǎn)1，2，黃強(qiáng)1，劉臣海1，劉振1，2，林先盛1，謝放1

摘要目的觀察microRNA-21（m iR-21）對(duì)裸鼠人膽管癌細(xì)胞移植瘤生長(zhǎng)及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）進(jìn)程的影響。

方法在兩組裸鼠側(cè)腹部皮下注射對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的膽管癌細(xì)胞QBC939和穩(wěn)定表達(dá)miR-21的QBC939-miR-21細(xì)胞，建立裸鼠移植瘤模型。采用Western blot、免疫組化及實(shí)時(shí)定量RTPCR法檢測(cè)EMT的上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-鈣粘蛋白（E-cadherin）和間質(zhì)標(biāo)志物N-鈣粘蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）的表達(dá)。結(jié)果QBC939-miR-21組移植瘤體積大于QBC939組（P＜0．05），且E-cadherin相對(duì)表達(dá)量降低，Vimentin、N-cadherin相對(duì)表達(dá)量增加。結(jié)論miR-21促進(jìn)了裸鼠膽管癌細(xì)胞移植瘤生長(zhǎng)和EMT進(jìn)程，為進(jìn)一步研究m iR-21在膽管癌中的功能及作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞膽管癌；microRNA-21；上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化；移植瘤

膽管癌是一種惡性度極高的起源于膽管上皮的腫瘤，手術(shù)切除率較低，術(shù)后復(fù)發(fā)率高，對(duì)于放、化療不敏感，導(dǎo)致該疾病預(yù)后較差［1］。大多數(shù)膽管癌患者在確診時(shí)已是晚期，術(shù)后腫瘤的復(fù)發(fā)率非常高，這往往與患者早期即發(fā)生腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移有關(guān)。microRNA-21（miR-21）是miRNA大家族中一個(gè)具有多種功能也是研究較多的miRNA，其被發(fā)現(xiàn)在大量腫瘤中表達(dá)升高［2－3］。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymal transition，EMT）被認(rèn)為和癌癥的轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)息息相關(guān)，其重要特征之一是上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-鈣黏蛋白（E-cadherin）表達(dá)缺失和間質(zhì)標(biāo)志物波形蛋白（Vimentin）和N-鈣黏蛋白（N-cadherin）表達(dá)升高。而miR-21可以通過(guò)誘導(dǎo)EMT進(jìn)程而促進(jìn)

2015－05－22接收

1　材料與方法

1．1材料

人膽管癌細(xì)胞QBC939由安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院肝膽胰外科安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自行保存，慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)miR-21的膽管癌細(xì)胞QBC939-miR-21及空白對(duì)照組QBC-NC在前期實(shí)驗(yàn)后凍存保存；SPF級(jí)BALB／C 4～5周齡雌性裸鼠16只，15～20 g，購(gòu)自上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；RNA抽提試劑盒購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清及青、鏈霉素購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；E-caherin、N-cadherin及Vimentin抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。

1．2方法

1．2．1實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)miR-21表達(dá)

收集各組細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)、傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞檢測(cè)miR-21的表達(dá)。按照TRIzol法抽提總RNA，以U6為內(nèi)參，Primer 5．0分別設(shè)計(jì)引物，U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游 引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；miR-21上游引物：5′-ACACTCCAGCTGGGTAGCTTATCAGACTGATG-3′，下游引物：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′，按照逆轉(zhuǎn)錄及PCR試劑盒說(shuō)明設(shè)置反應(yīng)體系及參數(shù)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所得數(shù)據(jù)經(jīng)內(nèi)參基因均一處理，通過(guò)2－ΔΔCt方式計(jì)算目標(biāo)基因表達(dá)差異以倍數(shù)表示。

1．2．2裸鼠皮下移植瘤模型的建立

膽管癌細(xì)胞QBC939及QBC939-miR-21細(xì)胞分別于16只裸鼠兩側(cè)背部皮靠后下接種，約0．1 ml／只，接種后待肉眼能觀察到腫瘤時(shí)開(kāi)始用微米卡尺測(cè)腫瘤體積。于第4周末處死全部裸鼠，剝離移植瘤稱重；腫瘤體積按以下公式計(jì)算：腫瘤體積（mm3）＝0．5×長(zhǎng)徑（mm）×短徑2（mm2）。

1．2．3免疫組化檢查瘤體部分組織

獲得瘤體后一部分于液氮中凍存，另一部分用4%多聚甲醛固定，切取合適大小材料（厚度約0．2 cm）進(jìn)行包埋，乙醇及二甲苯溶液脫水，石蠟包埋后的標(biāo)本在二甲苯溶液脫蠟，逐層梯度酒精和蒸餾水水化，檸檬酸鹽緩沖液（pH＝6．0）處理后行抗原修復(fù)，正常山羊血清封閉處理15 min，用一抗4℃處理過(guò)夜，相應(yīng)二抗和DAB顯色處理，蘇木精復(fù)染、脫水、封片。E-cadherin主要在腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜中表達(dá)染色，≥90%為正常表達(dá)，＜90%為缺失表達(dá)［5］。N-cadherin、Vimentin等主要在腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)染色，≥20%為陽(yáng)性表達(dá)，否則相反［6］。標(biāo)本均經(jīng)由兩名病理醫(yī)師證實(shí)。

1．2．4實(shí)時(shí)定量RT-PCR法檢測(cè)EMT相關(guān)蛋白的相對(duì)表達(dá)量

液氮罐中取出組織，運(yùn)用TRizol法提取總RNA，以GAPDH作為內(nèi)參基因，以Primer 5．0分別設(shè)計(jì)引物，按照逆轉(zhuǎn)錄及PCR試劑盒說(shuō)明設(shè)置反應(yīng)體系及參數(shù)，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA和PCR擴(kuò)增。內(nèi)參片段 GAPDH為299 bp，目的片段E-cadherin為94 bp，N-cadherin為201 bp，Vimentin為278 bp。所得數(shù)據(jù)處理同1．2．1。

1．2．5Western blot法檢測(cè)EMT相關(guān)蛋白表達(dá)

將各組40 mg組織塊盡量剪碎，加RIPA裂解液（含PMSF和Cocktail）于勻漿器中，然后將裂解液于4℃、14 000 r／min離心10 min，獲得總蛋白后4℃過(guò)夜，Lowry法蛋白定量，紫外分光光度計(jì)測(cè)量組織蛋白濃度后將蛋白濃度調(diào)至5μg／μl，再經(jīng)PAGE電泳將蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜上；5%脫脂奶粉封閉30min后，分別加入各目標(biāo)蛋白一抗，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶2 000）反應(yīng)、孵育，利用 X光膠片曝光、顯影、定影、拍照，用Image J軟件進(jìn)行條帶灰度分析。以GAPDH作為對(duì)照，目的蛋白的灰度值／對(duì)照GAPDH灰度值的比值表示蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1．3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17．0軟件進(jìn)行分析，兩組計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，多組計(jì)量資料分析采用方差分析。

2　結(jié)果

2.1實(shí)時(shí)定量 RT-PCR檢測(cè) m iR-21在各細(xì)胞組的表達(dá)

分別收集QBC939-miR-21組、QBC939-NC組及QBC939組細(xì)胞抽提RNA，檢測(cè)miR-21的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示QBC939-miR-21組 miR-21表達(dá)量（32．27±1．05），較 QBC939-NC組（1．00±0．01）及QBC939組（0．75±0．01）高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝18．32，P＜0．01），而QBC939-NC組與QBC939組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖1。

2.2m iR-21對(duì)裸鼠皮下膽管癌移植瘤生長(zhǎng)的影響

每天測(cè)量移植瘤體積，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線（圖2）。結(jié)果顯示，QBC939-miR-21組腫瘤的增長(zhǎng)速度明顯比QBC939組腫瘤的增長(zhǎng)速度快，其中QBC939組有1只小鼠始終未成瘤。于第4周末剝離移植瘤后稱重（圖3），組織的一部分于－80℃凍存，另一部分于4%多聚甲醛固定。QBC939-miR-21組移植瘤重為（0．50±0．23）g，QBC939組重量為（0．23± 0．11）g，兩組移植瘤重量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝2．85，P＜0．05），見(jiàn)圖4，miR-21在小鼠體內(nèi)可明顯促進(jìn)腫瘤組織的增殖與生長(zhǎng)。

2.3免疫組化法檢測(cè)兩組移植瘤E-cadherin、N-cadherin、Vim entin蛋白表達(dá)

免疫組化法檢測(cè)兩組裸鼠皮下移植瘤E-cadherin缺失率及N-cadherin 和Vimentin陽(yáng)性表達(dá)率，QBC939組與QBC939-miRNA-21組E-cadherin缺失率、N-cadherin陽(yáng)性表達(dá)率及Vimentin陽(yáng)性表達(dá)率分別為57．1%（4／7）vs 75．0%（6／8）、71．4%（5／7）vs 87．5%（7／8）、57．1%（4／7）vs75．0%（6／8）。結(jié)果證實(shí)miR-21的上調(diào)表達(dá)能夠降低E-cadherin的表達(dá)，增加 N-cadherin及Vimentin表達(dá)（圖5）。

2.4實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)兩組移植瘤E-cadherin、N-cadherin、Vim entin m RNA表達(dá)量

實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)QBC939組與QBC939-miR-21組E-cadherin、N-cadherin及Vimentin mRNA相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果提示 QB939-miR-21組較 QBC939組裸鼠皮下移植瘤E-cadherin表達(dá)降低，N-cadherin及Vimentin表達(dá)增高。見(jiàn)圖6。

2.5W estern blot法檢測(cè)E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)量

Western blot法檢測(cè)QBC939組與 QBC939-miR-21組E-cadherin蛋白表達(dá)量（2．02±0．79 vs0．34±0．08），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t ＝5．2，P＜0．01），N-cadherin蛋白表達(dá)量（0．20± 0．05 vs 0．87±0．42），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝－4．012，P＜0．05），Vimentin蛋白表達(dá)量（0．32±0．17 vs1．16±0．58），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝－3．429，P ＜0．05）。結(jié)果表明，QB939-miR-21組較QBC939組裸鼠皮下移植瘤E-cadherin表達(dá)降低，N-cadherin及Vimentin表達(dá)增高。見(jiàn)圖7。

3　討論

microRNA是一類(lèi)通過(guò)與靶mRNA的3′非翻譯區(qū)互補(bǔ)結(jié)合，引起靶基因的抑制翻譯或降解的內(nèi)源性非編碼小分子RNA。miR-21作為microRNA家族中被較早發(fā)現(xiàn)的成員之一，其編碼基因位于17q23．1染色體上，與跨膜蛋白49（TMEM49）基因重疊［7］。研究［8－9］證實(shí)miR-21在多種惡性腫瘤中處于高表達(dá)水平，如肝癌、結(jié)直腸癌、胃癌、乳癌等，并能顯著提高腫瘤的生長(zhǎng)及侵襲轉(zhuǎn)移能力，在腫瘤的進(jìn)展及評(píng)估預(yù)后中發(fā)揮重要作用。本試驗(yàn)中通過(guò)慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建成功的上調(diào)了QBC939細(xì)胞中miR-21的表達(dá)，通過(guò)小鼠的皮下移植瘤模型構(gòu)建，顯示轉(zhuǎn)染后的QBC939細(xì)胞形成的皮下移植瘤較對(duì)照組，生長(zhǎng)速度及重量都明顯加強(qiáng)，提示miR-21在膽管癌中也發(fā)揮著促癌基因的作用，能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。

膽管癌的侵襲與轉(zhuǎn)移通常是影響術(shù)后患者生存率的主要因素之一，而近年來(lái)越來(lái)越多的證據(jù)［10］表明，EMT現(xiàn)象是腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲與轉(zhuǎn)移的機(jī)制之一。EMT是指上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過(guò)程，是胚胎發(fā)育過(guò)程中的一種生理現(xiàn)象，也是腫瘤細(xì)胞具有遷移性和侵襲性的一個(gè)主要原因。其細(xì)胞表型發(fā)生改變，以E-cadherin表達(dá)缺失和N-cadherin、Vimentin陽(yáng)性表達(dá)為EMT現(xiàn)象的標(biāo)志［11］。大量的miRNA被發(fā)現(xiàn)能直接或間接的參與EMT進(jìn)程的調(diào)控，其中以miR-200以及miR-34家族研究［12］較多。本團(tuán)隊(duì)前期研究［13］顯示miR-21在膽管癌組織中表達(dá)較癌旁組織及正常組織都高，體外實(shí)驗(yàn)［4］也證實(shí)了miR-21在膽管癌細(xì)胞中可以通過(guò)誘導(dǎo)EMT進(jìn)程促進(jìn)膽管癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移。本研究利用免疫組化、Western blot、qRT-PCR法對(duì)皮下移植瘤組織的檢測(cè)顯示，上調(diào)表達(dá) miR-21的 QBC939細(xì)胞其構(gòu)建移植瘤組織較空白對(duì)照組小鼠移植瘤組織中E-cadherin表達(dá)減低，N-cadherin及Vimentin表達(dá)增強(qiáng)。以上均表明miR-21能夠通過(guò)調(diào)節(jié)EMT相關(guān)分子的表達(dá)從而誘導(dǎo)EMT進(jìn)程，也進(jìn)一步證實(shí)了miR-21能夠通過(guò)促進(jìn)EMT進(jìn)程從而影響膽管癌的侵襲與轉(zhuǎn)移。

參與誘導(dǎo)或調(diào)控EMT進(jìn)程的因素十分復(fù)雜，其被大量的細(xì)胞的信號(hào)所調(diào)節(jié)并最終激活轉(zhuǎn)錄因子，如Twist，Snail及Zeb等。Bao et al［14］在肝癌中發(fā)現(xiàn)miR-21能通過(guò)調(diào)節(jié)PTEN和hSulf-1介導(dǎo)的AKT和ERK信號(hào)通路誘導(dǎo)EMT的發(fā)生，而B(niǎo)in et al［15］發(fā)現(xiàn)在胰腺癌中Notch-1信號(hào)通路或許介導(dǎo)了miR-21誘導(dǎo)EMT進(jìn)程的發(fā)生，而在膽管癌中miR-21通過(guò)何種信號(hào)通路誘導(dǎo)EMT的發(fā)生還需進(jìn)一步研究，本團(tuán)隊(duì)下一步將就這一現(xiàn)象利用基因芯片的技術(shù)進(jìn)行更深入的探討，進(jìn)而為膽管癌的診斷以及靶向治療提供更為切實(shí)可靠的理論依據(jù)。

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中圖分類(lèi)號(hào)R 73-37

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000－1492（2015）10－1399－05

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：81272397）；安徽省自然科學(xué)基金（編號(hào)：1208085MH176）

作者單位：安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院1普通外科、2肝膽胰外科安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥230001

作者簡(jiǎn)介：晉志遠(yuǎn)，男，碩士研究生；黃強(qiáng)，男，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：hq-sohu＠．com膽管癌的侵襲轉(zhuǎn)移能力［4］，該研究進(jìn)一步用體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-21與EMT在膽管癌中的關(guān)系。

Effect ofm icroRNA-21 on EMT of human cholangiocarcinoma xenografts in nudem ice

Jin Zhiyuan1，2，Huang Qiang1，Liu Chenhai1，et al
（1Dept of General Surgery，2Key Laboratory of Hepatopancreatobiliary Surgery of Anhui Province，The Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University，Hefei230001）

AbstractObjectiveTo observe the effects ofmicroRNA-21（miR-21）on the epithelial-mesenchymal transition （EMT）of human cholangiocarcinoma xenografts in nude mice．MethodsQBC-939 and QBC939-miR-21 cholangiocarcinoma cellswere subcutaneously injected into two groups of nudemice respectively as xenografts，expressions of E-cadherin，N-cadherin and Vimentin were detected by Western blot，RT-PCR and immunohistochemical analysis．ResultsCompared with group QBC939，group QBC939-miR-21 xenografts showed the greater tumor weight and rapider growth，expression of E-cadherin decreased，whereas the protein expressions of Vimentin and N-cadherin increased．ConclusionmiR-21 overexpression enhances tumor growth，which promotes EMT phenotype and the foundation for further study ofmiR-21 function in cholangiocarcinoma andmechanism is established．

Key wordscholangiocarcinoma；microRNA-21；EMT；xenograft