大鼠非酒精性脂肪肝病程中細胞色素P450酶的分析

余　慶，許　曼，趙倩茹，林元節(jié)，陳　偉，金　涌

大鼠非酒精性脂肪肝病程中細胞色素P450酶的分析

余慶，許曼，趙倩茹，林元節(jié)，陳偉，金涌

摘要目的探討4種主要的細胞色素P450酶在非酒精性脂肪肝（NAFLD）發(fā)病進程中的表達變化。方法建立大鼠NAFLD的病理模型，并分別測定肝勻漿中谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和三酰甘油（TG）等生化指標(biāo)。采用Western blot法檢測在各個病理時期CYP1A2、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A1的表達水平的變化。結(jié)果隨著NAFLD嚴(yán)重程度的增加，AST與ALT的活性顯著上升（P＜0．01），TG的水平則在重度脂肪肝時期之前上升，而后顯著下降（P ＜0．01）。CYP1A2和CYP2D6的表達水平在發(fā)病進程中總體呈下降趨勢，CYP3A1雖總體下調(diào)，但幅度不大，而CYP2E1的表達水平則明顯上升（P＜0．01）。結(jié)論在NAFLD的發(fā)病進程中CYP1A2、CYP2D6、CYP3A1和CYP2E1的表達水平發(fā)生明顯的改變，實驗結(jié)果可以為內(nèi)科醫(yī)師針對NAFLD患者的用藥提供指導(dǎo)。

關(guān)鍵詞非酒精性脂肪肝；細胞色素P450酶；肝勻漿；蛋白表達

非酒精性脂肪肝（non－alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一種并非由于過度飲酒、自身免疫、藥物感染等因素所導(dǎo)致的一種以彌漫大泡性脂肪為主要特征的臨床病理綜合征。其包括良性的肝臟脂肪變性、由其演變的非酒精性脂肪性肝炎和肝硬化，并最終有可能導(dǎo)致肝臟功能障礙［1－2］。NAFLD的常見病因有肥胖、藥物損傷、高脂血癥與糖尿病等。NAFLD的病理過程非常復(fù)雜，涉及體內(nèi)的眾多角度與層次的生理生化過程，尚不能以單一的機制解釋。對于NAFLD的發(fā)病機制，現(xiàn)在比較認(rèn)同的是“二次打擊”學(xué)說［3－4］。細胞色素P450（cytochrome P450，CYP450）是一類主要存在于肝臟和腸道的單加氧酶系，可參與脂肪酸類固醇激素等內(nèi)源性底物的氧化和代謝、固醇類的生物合成以及大部分藥物和外源物的生物氧化等，并催化多種內(nèi)源性物質(zhì)和外源性物質(zhì)的代謝［5］。目前，針對NAFLD發(fā)病進程中CYP450酶的變化的研究尚且很少。該研究主要以NAFLD發(fā)展進程中各病理階段的大鼠為研究載體，利用Western blot法探討與臨床藥物代謝密切相關(guān)幾種主要的CYP450酶的表達變化，旨在對NAFLD患者進行臨床個體化用藥，以提高療效和減少不良反應(yīng)。

2015－05－08接收

1　材料與方法

1．1材料

1．1．1實驗動物

健康雄性SD大鼠60只，體重（210±20）g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，給予正常飲食，標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境適養(yǎng)1周。

1．1．2主要試劑

谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）和三酰甘油（triglyceride，TG）測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；CYP1A2抗體、CYP2E1抗體、CYP2D6抗體和CYP3A1抗體購自北京博奧森科技有限公司；BCA測定試劑盒、ECL顯影液購自上海碧云天生物技術(shù)研究所；山羊抗兔IgG及抗β-actin抗體購自美國Santa Cruz公司。

1．1．3主要儀器

全波長酶標(biāo)儀（型號：uQuant，美國Biotek公司）、顯影儀（型號：ChemiQ 4600，上海歐翔科學(xué)儀器有限公司）。

1．2方法

1．2．1實驗動物分組與NAFLD模型制備

大鼠適養(yǎng)1周后，隨機分為4組，每組15只。從第2周始處死一批大鼠（對照組），其后用自制的高脂乳劑［6］（17%蔗糖＋46%花生油＋17%膽固醇＋4%吐溫80＋9%全脂奶粉＋4%丙二醇＋1%脫氧膽酸＋1%食鹽）對大鼠每日進行灌胃（10 mg／kg），并分別在第9周、第13周、第17周處死一批大鼠（具體造模的時間通過前期預(yù)實驗來確定）。

1．2．2病理學(xué)檢查與重新分組

在上述時期分別斷頭處死一批大鼠，取肝臟組織并洗凈，后置于含10%的甲醛溶液中固定，石蠟包埋，HE染色，顯微鏡下觀察各期肝臟組織樣本的病理學(xué)改變情況，并按照文獻［7］中的評分標(biāo)準(zhǔn)進行分級評分，最后統(tǒng)計評分結(jié)果。根據(jù)評分結(jié)果，按照所獲NAFLD模型的嚴(yán)重程度，重新分為4組（每組挑選8只），即正常組、輕度脂肪變性組、重度脂肪變性組、脂肪性肝炎組（后續(xù)實驗均按照此分組進行）。

1．2．3肝組織勻漿中AST、ALT、TG水平的測定

分別取200 mg正常組、輕度脂肪變性組、重度脂肪變性組以及脂肪性肝炎組的大鼠肝組織，按1∶9的比例加入生理鹽水，用手動勻漿器冰上進行勻漿，轉(zhuǎn)移至離心機中，2 500 r／min離心10 min，取上清液，分別按照試劑盒操作方法進行測定。

1．2．4肝組織蛋白的提取

分別取100 mg各組大鼠樣本的肝組織，加入裂解液1 ml與PMSF 10μl，剪碎勻漿后裂解30 min，4℃、12 000 r／min離心30 min，取上清液并根據(jù)BCA蛋白測定試劑盒上操作對蛋白進行定量。蛋白溶液與上樣緩沖液按4∶1的比例，于100℃水浴煮沸10 min，冷卻后于－80℃保存。

1．2．5Western blot法測定肝組織勻漿中CYP1A2、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A1蛋白的表達

蛋白樣品和標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker一起進行SDS-PAGE電泳，后200 mA濕法轉(zhuǎn)膜50 min，用5%的脫脂牛奶TBST溶液室溫封閉3 h，用一抗（1∶800）于4℃孵育過夜，TBST洗膜，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶10 000）于脫脂牛奶中室溫孵育1 h，TBST溶液洗膜，用ECL顯影劑進行顯影，并分析顯影結(jié)果。

1．3統(tǒng)計學(xué)處理

2　結(jié)果

2．1高脂肪乳劑誘導(dǎo)的大鼠肝臟組織的病理學(xué)結(jié)果

光鏡下，對照組肝臟組織中肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，匯管區(qū)未出現(xiàn)異常（圖1A）；自高脂肪乳劑灌胃后，模型組此后各周均出現(xiàn)不同程度的肝細胞脂肪變性，第9周時，組別中極大多數(shù)大鼠肝臟組織處于輕度脂肪變性（含脂滴范圍比例約為5%～33%），伴隨著少量的炎性細胞浸潤（圖1B）；第13周時，組別中大鼠肝組織光鏡視野下都出現(xiàn)肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，并伴隨大量的大泡性脂肪空泡（含脂滴范圍比例大于66%），炎癥細胞浸潤明顯，屬于重度脂肪變性時期（圖1C）；第17周時，組別中大鼠大多數(shù)肝組織匯管區(qū)出現(xiàn)大量的炎細胞浸潤，假小葉內(nèi)相鄰肝細胞干酪樣壞死并膨脹突出，提示進入脂肪性肝炎時期（圖1D）。根據(jù)最終染色結(jié)果與NAFLD診斷標(biāo)準(zhǔn)，每個時期中挑選合適數(shù)量、造模效果比較好的樣本進行后續(xù)研究。

2.2肝組織勻漿中AST、ALT、TG水平

NAFLD的發(fā)展進程中，肝組織勻漿中AST、ALT的活性顯著上升（F＝11．243、598．967，P＜0．01），ALT與AST的比值在進程中逐漸由小于1轉(zhuǎn)變?yōu)榇笥?。而TG的水平在正常組和重度脂肪變性組這個進程區(qū)間中是明顯上升的，但脂肪性肝炎組的數(shù)值比重度脂肪變性組明顯下降（F＝80．313，P＜0．01），見表1。

表1　NAFLD不同時期肝組織勻漿中AST、ALT、TG的測定結(jié)果（n＝3，±s）

表1　NAFLD不同時期肝組織勻漿中AST、ALT、TG的測定結(jié)果（n＝3，±s）

與正常組比較：**P＜0．01；與重度脂肪變性組比較：＃＃P＜0．01

組別　AST（U／gprot）　ALT（U／gprot）　TG（mmol／gprot）34．11±2．88　31．57±1．26　0．132 8±0．016 0輕度脂肪變性　57．22±4．90　45．24±1．50　0．224 0±0．047 8重度脂肪變性　68．62±13．53　78．97±0．75　0．657 4±0．033 5脂肪性肝炎　70．44±1．02**　83．24±2．05**　0．363 2±0．032 4**＃＃正常

2.3肝組織勻漿中 CYP1A2、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A1的表達

NAFLD的發(fā)展進程中，CYP1A2、CYP2D6和CYP3A1總體呈下降趨勢。其中脂肪性肝炎組與正常組比較，CYP1A2（F＝68．425，P＜0．01）和CYP2D6（F＝287．895，P＜0．01）的下降幅度非常明顯，而CYP3A1的總體則呈略微下降（F＝12．098，P＜0．05），過程中僅重度脂肪變性組和輕度脂肪變性組比較有下降（F＝5．352，P＜0．05），其它病理時期過程中差異無統(tǒng)計學(xué)意義。CYP2E1在進程中持續(xù)呈上升趨勢，其中輕度脂肪變性組和正常組比較（F＝11．307，P＜0．01），脂肪性肝炎組與重度脂肪變性組比較均顯著上升（F＝53．454，P＜0．01）。見圖2～5。

3　討論

該實驗通過利用高脂肪乳劑成功誘導(dǎo)了NAFLD發(fā)病進程中的4個時期模型。病理學(xué)結(jié)果顯示，肝臟第9周出現(xiàn)輕度的脂肪變性，第13周出現(xiàn)重度的脂肪變性，第17周出現(xiàn)脂肪性肝炎。實驗過程中，由于中度脂肪變性（含脂滴33%～66%）出現(xiàn)時間很短，很容易直接過渡到重度脂肪變性，組織樣本獲取僅2例，故實驗中沒有設(shè)置中度脂肪變性組。

NAFLD發(fā)病機制的“二次打擊”學(xué)說中的“初次打擊”即肝臟脂肪蓄積、胰島素抵抗，其中胰島素抵抗是脂質(zhì)在肝臟內(nèi)累積的開端。“二次打擊”主要是氧化應(yīng)激和脂質(zhì)的過氧化反應(yīng)。是由氧化應(yīng)激所導(dǎo)致的脂質(zhì)過氧化損傷以及其異常細胞因子的作用所導(dǎo)致的肝臟炎癥與肝臟纖維化，并最終可能導(dǎo)致肝臟壞死。而氧化應(yīng)激條件下線粒體產(chǎn)生的氧自由基則能以多種方式誘導(dǎo)肝臟損傷，主要通過與生物分子（如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸等）的相互作用，從而改變其結(jié)構(gòu)并且影響功能。

在NAFLD的發(fā)病期間，肝臟的代謝功能受到很大的影響，與代謝密切相關(guān)的肝藥酶可能會發(fā)生改變，但肝藥酶具體如何改變的報道目前并不多。CYP1A2主要參與華法林、茶堿、美西律、硝苯地平、非那西丁等多種藥物的代謝過程，同時在一些前毒性物質(zhì)和前致癌物的體內(nèi)活化過程中也起重要作用［8］；經(jīng)CYP2D6代謝的藥物占總P450代謝藥物的30%，主要參與抗精神病、抗心律失常、抗抑郁癥等多種臨床常用藥物的代謝，是最具有遺傳多態(tài)性的酶系，與許多藥物代謝和疾病的易感性有關(guān)［9］；CYP2E1可介導(dǎo)多種化合物所致的肝損傷效應(yīng)，如乙醇、氯仿、對乙酰氨基酚等，被認(rèn)為是機體對環(huán)境和毒物或致癌物敏感程度重要的決定因素［10］；CYP3A4是人肝臟中CYP450酶系中最重要的成分，約占30%～40%，在許多內(nèi)源性和外源性化合物的代謝中起著重要作用，參與了尼莫地平、環(huán)孢菌素、利多卡因等150多種藥物的代謝，大鼠CYP450酶系中沒有CYP3A4亞型，與之功能相對應(yīng)的是CYP3A1／3A2［11］。

本研究表明，在NAFLD的發(fā)病進程中，CYP1A2 和CYP2D6下降幅度非常明顯，CYP3A1的下降幅度卻微乎其微，CYP2E1則是呈上升趨勢。以往的報道［12］表明，CYP1A2在腫瘤壞死因子α和白介素1β炎癥細胞因子的存在下會明顯下降，而NAFLD的發(fā)病機制與炎癥的增多有關(guān)，這可能是CYP1A2蛋白表達顯著下降的原因。研究［13］顯示，CYP2D6和眾多亞型如CYP1A2、CYP3A4的活性均呈現(xiàn)下降的趨勢，本實驗結(jié)果與之相符。CYP2E1是針對脂肪肝研究較多的P450亞型之一，研究［14－15］表明CYP2E1表達水平的明顯升高與脂質(zhì)過氧化水平顯著升高密切相關(guān)，在脂肪肝狀態(tài)下，胰島素抵抗加強，肝臟蓄積過多的脂肪，使酮體增加而導(dǎo)致高酮體血癥，從而會誘導(dǎo)CYP2E1的表達增加。CYP2E1在電子的傳遞過程中，很容易出現(xiàn)偶聯(lián)，產(chǎn)生氧自由基進而引起細胞損傷。

近年來在許多有關(guān)CYP450酶系與NAFLD之間關(guān)系的研究中，不同的CYP450酶系在NAFLD不同病理階段所發(fā)揮的作用各有不同。如若對于P450酶系各亞型的作用機制做出深入的探究，那么針對NAFLD不同階段的治療即可真正從分子水平入手，臨床可以根據(jù)肝藥酶的活性適當(dāng)增加或減少給藥劑量，或給予適當(dāng)?shù)募觿┗蛞种苿﹣碚{(diào)節(jié)酶的活性，從而達到最佳治療效果并避免不必要的毒性。

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中圖分類號R 966；R 575．5

文獻標(biāo)志碼A

文章編號1000－1492（2015）10－1385－05

基金項目：安徽省高等學(xué)校省級自然科學(xué)研究重點項目（編號：KJ2013A153）

作者單位：安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，合肥230032

作者簡介：余慶，男，碩士研究生；金涌，男，教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：aydyjs＠163．com

Analysis of hepatic cytochrom e P450 enzymes in rats with progressive stages of non-alcoholic fatty liver disease

Yu Qing，Xu Man，Zhao Qianru，et al
（School of Pharmacy，AnhuiMedical University，Hefei230032）

AbstractObjectiveTo study the alterations of cytochrome P450 enzymes in rats liver with progressive stages of non-alcoholic fatty liver disease（NAFLD）．MethodsNAFLD models were established．Activities of hepatic aspartate aminotransferase（AST），alanine aminotransferase（ALT）and levels of triglyceride（TG）were measured by assay kit．The CYP1A2，CYP2D6，CYP2E1 and CYP3A1 protein expressions were detected byWestern blot analysis．Resu ltsHigher activities of ALT and AST were detected（P＜0．01）as the severity of NAFLD increased．TG levels increased remarkably in the range from normal to serious steatosis，and then decreased dramatically．Protein expressions of CYP1A2，CYP2D6 and CYP3A1 tended to decrease with NAFLD progression while CYP2E1 was increased consecutively．ConclusionThese results suggest that significant and novel changes occur in hepatic P450 expression during progressive stages of NAFLD．Itmay provide a valuable framework for physicianswhen determining the pharmacotherapeutic options and dosing regimens to patients with this disease．

Key wordsnon-alcoholic fatty liver disease；cytochrome P450 enzyme；liver homogenate；protein expression