弓形蟲棒狀體ROP16基因轉染RAW 264.7的實驗研究

謝園園，徐元宏，聞慧琴，3，王書書，李源玲，儲德勇，沈繼龍

◇基礎醫學研究◇

弓形蟲棒狀體ROP16基因轉染RAW 264.7的實驗研究

謝園園1，徐元宏2，聞慧琴2，3，王書書1，李源玲1，儲德勇1，沈繼龍1

摘要目的比較目前常用的5種基因導入技術將弓形蟲棒狀體ROP16基因導入RAW264．7，選擇合適的方法提高轉染效率。方法以綠色熒光蛋白pEGFP-ROP16融合表達構建質粒，采用Lipofectamine?3000、Attractene、Fugene?HD轉染試劑以及電穿孔轉染和慢病毒載體感染RAW264．7，利用熒光顯微鏡和流式細胞儀觀察目的基因的表達、細胞生長狀態并分析轉染效率，從而確定最佳的基因導入途徑。結果上述質粒載體對RAW264．7的轉染效率依次為電轉法＞Fugene?HD＞Lipofectamine?3000＞Attractene。但是電轉法轉染后細胞死亡率較高，細胞貼壁不牢或死亡；而慢病毒感染效率可達61．2%，細胞生長狀態佳，顯著優于質粒載體（P ＜0．05）。慢病毒組顯著優于4個質粒組（P＜0．05）。結論慢病毒感染可將弓形蟲棒狀體ROP16成功轉入RAW264．7，具有較高的轉染效率，效果顯著優于質粒載體，目的基因在細胞內獲得高效表達。為弓形蟲ROP16的功能研究提供了重要基礎。

關鍵詞ROP16基因；RAW264．7；慢病毒感染

弓形蟲廣泛寄生于溫血動物的有核細胞內，能夠侵入單核巨噬細胞并在細胞內增殖。棒狀體蛋白16（rhoptry protein 16，ROP16）是由蟲體棒狀體分泌的重要毒力相關因子，具有激酶樣活性，可以直接磷酸化Stat3和Stat6［1－2］，上調白介素（interleukin，IL）-4和下調IL-12的表達，誘導替代活化型巨噬細胞（alternatively activated amcrophage，M2）／輔助性T細胞2（helper T cell2，Th2）的免疫偏移或極化。研究［3－4］表明，ROP16蛋白可促進M2的活化及Th2應答。巨噬細胞在機體中分布廣泛并具有十分活躍的生物學功能［5］。目前對于巨噬細胞的研究［6］主要著重于其異質性，在不同的微環境條件下可向經典活化型或M2偏移或者極化，各自發揮不同的細胞內殺傷、炎癥反應、免疫調節和組織重構等作用。目前研究［7－8］的細胞載入技術主要有非病毒導入系統（磷酸鈣法、脂質體法、電穿孔法等）和病毒導入系統（病毒載體）。但各有優缺點，且大都操作較復雜，轉染效率較低，設備要求較高。該研究分別采用ROP16重組質粒和重組慢病毒將目的基因導入小鼠單核巨噬細胞白血病細胞系RAW264．7，采用Lipofectamine?3000、Attractene、Fugene?HD轉染試劑，及電穿孔轉染法、慢病毒感染法轉染RAW264．7，比較5種基因導入方法的轉染效率，為深入研究ROP16的結構及其功能奠定基礎。

1　材料與方法

1．1材料

1．1．1細胞與主要試劑

RAW 264．7巨噬細胞系購自上海中科院研究所；Lipofectamine?3000轉染試劑（美國Invitrogen公司）；Attractene轉染試劑（德國QIAGEN公司）；Fugene?HD轉染試劑（美國Promega公司）；高糖DMEM培養基、胎牛血清（加拿大Wisent公司）；OptiMEM培養基（美國Gibco公司）；AxyPrep質粒大量提取試劑盒（美國Axygen公司）；胰酶和青霉素、鏈霉素（上海碧云天公司）；L-谷氨酰胺（北京Solarbio公司）；AnnexinV-FITC細胞凋亡檢測試劑盒（南京凱基公司）；通用型內質網形態高質染色試劑盒（上海江萊公司）；DAPI染色試劑盒（上海貝博生物）；慢病毒試劑盒（上海吉凱基因公司）。

1．1．2主要儀器

電穿孔儀、2 mm石英電轉杯（美國BioRad公司）；熒光顯微鏡IX71（日本Olympus公司）；流式細胞儀FACS Calibur（美國BD公司）；CO2培養箱（美國Thermo公司）；激光共聚焦掃描顯微鏡SP5-DMI6000（德國LEICA公司）；超凈工作臺（蘇州安泰公司）。

1．2方法

1．2．1質粒提取

弓形蟲Wh3蟲株ROP16基因

2015－05－26接收

科大學第一附屬醫院2檢驗科、3輸血科，合肥230022

沈繼龍，男，教授，博士生導師，責任作者，E-mail：shenjilong53＠126．com；

儲德勇，男，副教授，責任作者，E-mail：chudeyong＠126．com由安徽省病原生物學省級重點實驗室擴增，總長2 124 bp。構建包含pE綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）-ROP16的質粒并將其轉化至大腸桿菌DH5a，單菌落增菌培養200 m l。用AxyPrep質粒大量提取試劑盒抽提和純化質粒，溶解于滅菌超純水，濃度調整為1 mg／ml，光密度（optical delnsity，OD）值OD260／OD280＝1．9。

1．2．2細胞復蘇與傳代

按常規方法復蘇RAW264．7，培養于含15%胎牛血清（fetal calf serum，FBS）的DMEM培養液中，在5%CO2和37℃飽和濕度下傳代培養。當細胞傳3代，密度達到80%左右時，用0．25%胰酶消化并移入試管中，1 000 r／min離心5 min，棄上清液后，用1 m l上述培養液重懸計數。將細胞傳至6孔板，1×106個／孔，用含10%FBS的DMEM培養液培養，待每孔內的細胞生長到70%～80%密度時開始轉染。

1．2．3流式細胞儀檢測轉染效率

收集鋪好在6孔板內的基因導入處理后的細胞用不含EDTA的胰酶消化收集（注：胰酶消化時間不易過長，否則容易引起假陽性）；用PBS洗滌細胞2次（2 000 r／min、離心5 min），收集1×105～5×105細胞；加入500 μl的Binding Buffer懸浮細胞；加入5μl Annexin VFITC混勻后，4℃避光，反應15 min；用PBS洗滌細胞1次（2 000 r／min、離心5 min），500μl PBS重懸細胞；上流式細胞儀前5 min加入5μl PI，混勻；室溫、避光、反應5～15 min，上機檢測（1 h內，進行熒光顯微鏡或流式細胞儀的觀察和檢測）。因蛋白為GFP，調試好流式細胞儀后，得出圖后將橫坐標改為FITC通道，縱坐標改為直方圖，可直接導出轉染效率數值的流式圖。

1.3Lipofectam ine3000轉染法

按Lipofectamine 3000轉染試劑盒操作步驟操作，轉染前更換細胞液。取EP管2個，1號管OptiMEM培養液125μl 與5μl lip3000轉染試劑混勻，2號管OptiMEM培養液125μl與10μl P3000和5μg質粒混勻，將2號管混勻后加入1號管，輕輕吹打混勻后室溫孵育5 min，加入6孔板，5%CO2、37℃孵育箱孵育，24 h后觀察細胞生長狀態及熒光強弱，流式細胞儀檢測轉染效率。

1.4Attractene轉染法

根據Attractene轉染試劑說明書針對RAW 264．7的操作步驟，轉染前更換細胞液。取EP管1個，加100μl OptiMEM培養液，加入1．2μg質粒，再加入轉染試劑4．5μl，室溫孵育10～15 min，加入6孔板內，5%CO2、37℃孵育箱孵育，24 h后觀察細胞生長狀態及熒光強弱，流式細胞儀檢測轉染效率。

1.5Fugene?HD轉染法

按Fugene?HD轉染試劑盒操作步驟，轉染前無需換液。取EP管1個，加150μl OptiMEM培養液，先加入質粒3．3μg；再加入Fugene?HD轉染試劑12μl，以得到適當的試劑與質粒的比例，輕柔混勻后，室溫孵育10～15 min，加入6孔板，24 h后觀察細胞生長狀態及熒光強弱，流式細胞儀檢測轉染效率。

1．6電轉染法

當細胞達70%～80%匯合時，胰酶消化后，加入培養基終止，和培養液一起轉移至50 m l的一次性離心管，用血球計數器確定細胞密度，然后在4℃、1 500 r／min離心10 min，去除上清液。用電轉染液cytomix重懸細胞，至3．75×107細胞／m l密度。添加200μl的細胞和10μg質粒于電轉染杯中，在室溫下孵育10 min，然后將電轉染杯置于電轉染儀中，設置電壓與電容參數后電擊。電擊后迅速轉移至含有6 m l培養液的培養瓶中，并在5%CO2、37℃孵育箱中孵育，24 h后觀察細胞生長狀態及熒光強弱，流式細胞儀檢測轉染效率。

1．7慢病毒感染法

1．7．1宿主細胞的準備

實驗前保證細胞良好生長狀態，實驗前1 d接種5×103個細胞于96孔培養板中，所加培養液體積為每孔90μl，1次實驗需要20個孔。進行病毒感染時細胞的匯合率約為50%左右。根據不同感染條件分為4組：①A組為正常培養基中直接加病毒感染；②B組為加病毒同時在培養基中添加5μg／m l的聚凝胺；③C組是將培養基更換成ENi．S．后加入病毒感染；④D組為在ENi．S．加病毒同時加5μg／ml的聚凝胺，每組均設有3個不同梯度的感染復數（multiplicity of infection，MOI）。在5%CO2、37℃孵育箱孵育8～12 h以后觀察細胞狀態，棄去細胞上清液，更換新鮮培養液。感染3 d后，觀察細胞生長狀態及熒光表達情況。

1．7．2細胞的感染

種植RAW264．7于6孔板中，當細胞匯合約50%時，正常培養液中直接加病毒感染，在5%CO2、37℃孵育箱孵育，每天觀察細胞生長狀態及熒光強弱，72 h后用流式細胞儀檢測轉染效率。

2　結果

正常的RAW264．7細胞形態為圓形或橢圓形，細胞在體外為激活狀態時，可呈多突形，貼壁較為牢固（圖1F）。

2.1Lipofectam ine?3000轉染法效果分析

6孔板內每孔各含Lipofectamine?3000 5μl、P3000 10 μl和質粒5μg，熒光顯微鏡下觀察有GFP表達（圖1A、2A），同樣的轉染方法重復操作3次。轉染后細胞生長狀態略欠佳，形態發生改變，少數細胞見有偽足，出現分化，流式細胞儀檢測轉染效率為6．83%（圖3A）。

2.2Attractene轉染法效果分析

6孔板內每孔各含Attractene轉染試劑4．5μl，質粒1．2μg，熒光顯微鏡下觀察有GFP表達（圖1B、2B），同樣的轉染方法重復操作3次。轉染后細胞生長狀態略欠佳，形態發生改變，少量有偽足，出現分化，流式細胞儀檢測轉染效率為1．05%（圖3B）。

2.3Fugene?HD轉染法效果分析

Fugene?HD轉染RAW264．7巨噬細胞，轉染試劑量與質粒比例為3．5∶1，6孔板內每孔各含轉染試劑12μl、質粒3．3μg，熒光顯微鏡下觀察有GFP表達（圖1C、2C），同樣的轉染方法重復操作3次。轉染后細胞生長狀態略欠佳，形態發生改變，少量有偽足，出現分化，流式細胞儀檢測轉染效率為10．1%（圖3C）。

2．4電轉染法效果分析

根據多次試驗結果，死亡率均較高，電擊后細胞狀態較差。設置實驗過程中相對較好的電轉程序如下：電壓200 V、電容960 μF、電阻無限大。熒光顯微鏡下觀察有GFP表達（圖1D、2D），同樣的轉染方法重復操作3次。但電轉后發現細胞死亡率超過50%，大量細胞不貼壁，處于懸浮狀態，并出現很多細胞碎片，貼壁細胞形態基本無變化。流式細胞儀檢測轉染效率為13．9%（圖3D）。

2．5慢病毒感染法效果分析

根據預實驗結果，加入病毒質粒后在不同的時間點觀察熒光表達情況，顯示72 h后細胞熒光表達較強（圖1E、2E），并且細胞的生長狀態佳，形態發生改變，一部分細胞伸出偽足，出現分化，流式細胞儀檢測轉染效率為61．2%（圖3E）。慢病毒感染后的細胞，pEGFP-ROP16質粒在細胞內發出綠色熒光，通用型內質網形態高質染色試劑盒染色內質網發出紅色光，DAPI染色試劑盒染色細胞核發出藍色光（圖4）。

2.65種基因導入方法轉染RAW 264.7的效率比較

用上述常見的5種不同的基因導入方法處理RAW264．7，結果顯示其轉染效率各有不同。不同方法轉染效率之間的比較見圖5。經統計學分析，各組數據不屬于正態分布，用非參數秩和檢驗，各組轉染效率不全相同，具有統計學意義（P＜0．05）。再利用Mann-Whitney U法比較兩兩之間差異性，慢病毒轉染法組與其他4組比較，差異有統計學意義（P＜0．05），故慢病毒感染法轉染RAW264．7轉染效率最高。

3　討論

將外源基因導入真核細胞是研究目的基因功能的重要手段。對于不同大小的目的基因和不同類型的靶細胞應當選擇不同的轉染方法，以提高轉染效率和轉染后靶細胞的存活率，為后繼實驗提供最佳的實驗條件。巨噬細胞在機體中分布廣泛并具有十分活躍的生物學功能，通過基因導入改變巨噬細胞的功能進而調節疾病的免疫狀態有望成為治療某些疾病的新方法。

本實驗目的基因片段為2 124 bp的弓形蟲毒力相關因子ROP16，因GFP在哺乳動物細胞表達穩定，置熒光顯微鏡下易于檢測，因此GFP是常用的標記分子［9］。將構建帶有GFP-ROP16融合基因的質粒導入RAW264．7中。

Lipofectamine?3000屬于陽離子脂質體轉染試劑，其通過靜電作用陽離子脂質體可介導反義分子探針吸附于帶負電荷的靶細胞表面［10］，脂質復合物通過直接融合或內吞途徑進入細胞，并貯存于核內體中，最終經轉錄和翻譯，產生目的基因編碼的蛋白。Lipofectamine?3000脂質體法是常用的轉染方法，研究［11］報道其有轉染效率高、安全、細胞毒性小、無免疫原性等優點。本實驗中，對RAW264．7的質粒轉染效率只有6．83%，可能的原因是：①可能與細胞的物種來源有關，細胞表面可能缺乏特異性受體［12］；②RAW264．7細胞是貼壁細胞，而脂質體轉染方法對于懸浮細胞和貼壁細胞轉染效率相差很大［13］。Attractene是一種非脂質體的脂類轉染試劑，可轉染幾乎所有的貼壁細胞。其也高度適用于DNA和siRNA或miRNA模擬物／抑制劑的共轉染，操作快速簡便，對細胞毒性極低。但在本實驗中其轉染效率只有1．05%。Fugene?HD是一種新型非脂質體試劑，試劑中帶正電荷的混合脂類分子與核酸中帶負電荷的磷酸基團形成穩定的轉染復合物。該復合物的正電荷與宿主細胞膜上的唾液酸殘基的負電荷結合；或該復合物被細胞內吞而攝入。本實驗中，該轉染法的轉染效率只有10．1%。電穿孔法廣泛應用于基因克隆、外源基因的表達、基因定位、基因圖譜的繪制等研究［14］。雖然有報道［15］電轉染具有高效、安全等優點，但是電穿孔也存在細胞死亡率較高，引起細胞融合從而影響細胞性狀和生長等問題［16］，本實驗中效率僅為13．9%，宿主細胞死亡率超過50%，顯然不適于后期實驗的要求。

在基因轉染載體中，慢病毒是具有良好前景的一種高效轉染載體。慢病毒本身分子穩定，對靶細胞損害小，插入的外源性基因比較穩定，而且能把目的基因整合到細胞核內基因組中，所以通過加入適當濃度的嘌呤霉素可以進行藥物篩選從而穩定傳代，并能穩定表達。本實驗慢病毒感染后，經證實其轉染效率高達61．2%。激光共聚焦掃描圖片顯示弓形蟲棒狀蛋白ROP16基因導入RAW264．7細胞后主要定位于細胞核內。普通及熒光顯微鏡下可見基因導入后的靶細胞生長狀態良好、形態發生改變并伸出偽足，推測宿主細胞可能被活化，這為后期研究ROP16基因功能以及巨噬細胞的極化提供了較為合適的實驗條件。為進一步穩定轉染其他具有篩選標記的目的基因到RAW264．7細胞中奠定了實驗基礎。

綜上所述，與質粒載體的各種轉染方法比較，采用慢病毒載體感染可將弓形蟲ROP16成功轉入RAW264．7巨噬細胞，并獲得目的蛋白的高效表達，被轉入的細胞生長狀態良好。本研究不僅為ROP16誘導巨噬細胞偏移／極化的功能研究奠定了基礎，也為獲得其它目的基因在巨噬細胞內的過表達提供借鑒。

參考文獻

［1］Spiegel R，Bach G，Sury V，etal．Amutation in the saposin A coding region of the prosaposin gene in an infant presenting as Krabbe disease：first report of saposin A deficiency in humans［J］．Mol Genet Metab，2005，84（2）：160－6．

［2］CampanaWM，O＇Brien JS，HiraiwaM，etal．Secretion of prosaposin，amultifunctional protein，by breast cancer cells［J］．Biochim Biophys Acta，1999，1427（3）：392－400．

［3］Jensen K D，Wang Y，Wojno E D，etal．Toxoplasma polymorphic effectors determinemacrophage polarization and intestinal inflammation［J］．Cell Host Microbe，2011，9（6）：472－83．

［4］Biswas S K，Mantovani A．Macrophage plasticity and interaction with lymphocyte subsets：cancer as a paradigm［J］．Nat Immunol，2010，11（10）：889－96．

［5］曹雪濤．免疫學前沿進展［M］．2版．北京：人民衛生出版社，2009：78．

［6］Gordon S．Alternative activation ofmacrophages［J］．Nat Rev Immunol，2003，3（1）：23－35．

［7］Sato M，Ito A，Akiyama H，et al．Effects of B-cell lymphoma 2 gene transfer tomyoblast cells on skeletalmuscle tissue formation usingmagnetic force-based tissue engineering［J］．Tissue Eng Part A，2013，19（1－2）：307－15．

［8］Sato M，Ito A，Kawabe Y，et al．Enhanced contractile force generation by artificial skeletal muscle tissues using IGF-1 gene-engineered myoblast cells［J］．JBiosci Bioeng，2011，112（3）：273－8．

［9］Chalfie M，Tu Y，Euskirchen G，et al．Green fluorescent protein as amarker for gene expression［J］．Science，1994，263（5148）：802 －5．

［10］王冰，張樹彪，周集體，等．陽離子脂質體介導的基因轉移機制［J］．中國組織工程研究與臨床康復，2011，15（8）：1459 －62．

［11］Dass C R，Walker T L，Burton M A．Liposomes containing cationic dimethyl dioctadecyl ammonium bromide：formulation，quality control，and lipofection efficiency［J］．Drug Deliv，2002，9（1）：11－8．

［12］Zuhorn I S，Engberts JB，Hoekstra D．Gene delivery by cationic lipid vectors：overcoming cellular barriers［J］．Eur Biophys J，2007，36（4－5）：349－62．

［13］Smith CC，Lynch AM，Gooderham N J．Evaluating the genetic toxicology of DNA-based products using existing genetic toxicology assays［J］．Mutagenesis，2003，18（3）：259－64．

［14］Valero A，Post JN，van Nieuwkasteele JW，et al．Gene transfer and protein dynamics in stem cells using single cell electroporation in a microfluidic device［J］．Lab Chip，2008，8（1）：62－7．

［15］AkashiH，MiyagishiM，Taira K．RNAi expression vectors in plant cells［J］．Methods Mol Biol，2004，252：533－43．

［16］Sandri M，Bortoloso E，Nori A，et al．Electrotransfer in differentiated myotubes：a novel，efficient procedure for functional gene transfer［J］．Exp Cell Res，2003，286（1）：87－95．

中圖分類號R 382．33

文獻標志碼A

文章編號1000－1492（2015）10－1367－06

基金項目：國家自然科學基金（編號：81471983，81171606）；安徽省高校省級自然科學研究項目（編號：KJ2014A106）

作者單位：1安徽醫科大學病原生物學教研室，合肥230032；安徽醫

作者簡介：謝園園，女，碩士研究生；

Experim ental study of Toxoplasma ROP16 gene transfection to RAW 264.7

Xie Yuanyuan1，Xu Yuanhong2，Wen Huiqin2，3，et al
（1Dept of Pathogen Biology，Anhui Medical University，Hefei230032；2Dept of Laboratory，3Dept of

Blood Transfusion，The First Affiliated Hospital of AnhuiMedical University，Hefei230022）

AbstractObjectiveFivemost commonly usedmethodswere compared to transfer Toxoplasma gondii rhoptry 16 gene into RAW264．7 in order to select the appropriate technique for improving transfection efficiency．Methods The following fivemethods of Lipofectamine?3000 Transfection Reagent，Attractene Transfection Reagent，Fugene?HD Transfection Reagent，electroporation transfection and lentiviral vectors were used to construct the recombinant plasmids and lentiviral vectors，which carried genes of Toxoplasma ROP16 and pEGFP fusion protein．RAW264．7 cells were subjected to transfection with the constructs individually．Then the expressions of the target gene，cellularmorphology and transfection efficiency were observed with fluorescencemicroscopy and flow cytometry．Results The transfection efficiency of the recombinant plasmids in RAW264．7 goes as follows：electroporation＞Fugene?HD＞Lipofectamine?3000＞Attractene．However，the plasmids-transfected host cells became vulnerable to deaths via electroporation．Comparatively，the high efficacy of 61．2%was achieved with lentivirus infection（P＜0．05）．In addition，statistic analyses showed that lentivirus infection of the host cells had obvious advantages over the tested plasmid vectors（P＜0．05）．ConclusionToxoplasma gondii ROP16 has been successfully transferred to RAW264．7 macrophages by lentivirus infection，which resultes in higher efficiency of tranfection and expression of Toxoplasma gondii ROP16 gene in the cells than those by plasmids．

Key wordsROP16 gene；RAW264．7；lentivirus infection