一種優化的橡膠樹木質部石蠟切片制作方法

蔡海濱++涂敏等

摘 要 針對常規石蠟切片方法無法制得橡膠樹木質部切片的問題，優化了橡膠樹木質部切片制作方法并進行了驗證評估。以3齡和30齡的橡膠樹木材為材料，經FAA固定、乙醇預處理后，增加了以冰醋酸軟化木質部這一步驟，用正丁醇取代二甲苯進行組織透明，其余步驟參考常規方法。結果表明，優化的石蠟切片方法可制作出完整、高質量的木質部切片，其木纖維的長度、寬度與硝酸離析所得到的木纖維一致度高，為橡膠樹成齡木材的解剖學研究提供了方法。

關鍵詞 橡膠樹 ；木質部 ；石蠟切片 ；木纖維

分類號 S794.1

An Improved Method for Paraffin Section Preparation of Hevea Xylem

CAI Haibin TU Min HU Yanshi

CHENG Han AN Zewei HUA Yuwei HUANG Huasun

（Rubber Research Institute /

Ministry of Agriculture Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Rubber Tree /

State Center for Rubber Tree Breeding， CATAS， Danzhou， Hainan 571737）

Abstract In this paper， we improved and evaluated paraffin section method of Hevea xylem compared to the conventional method. 3-year-old and 30-year-old rubber tree woods were collected， fixed in FAA， pretreated by ethanol， softened by acetic acid and transparentized by n-butanol replacing xylene. The remaining steps referenced conventional method. The result indicated that the improved method could produce complete， high quality paraffin section of Hevea xylem. The length and width of wood fiber by paraffin section had high consistency with those obtained by nitrate segregation， which provided a method for the study of mature Hevea wood anatomy.

Keywords Hevea brasiliensis ； xylem ； paraffin section ； wood fiber

中國位于太平洋西岸，海南和廣東等沿海地區橡膠生產經常遭受臺風的嚴重危害[1]。據統計，1951～1990年間，熱帶風暴和臺風在海南登陸共62次，平均每年1.55次[2]。解決橡膠樹的抗風問題是這些地區橡膠樹栽培與持續高產、穩產的重要措施之一。研究表明，橡膠樹風害是各種生物和非生物因子的綜合作用結果。與弱抗風品種相比較，抗風品種木材纖維較粗短、壁較薄、腔徑較大[3-4]。因此，橡膠樹木質部石蠟切片制作在橡膠樹抗風因子研究中非常重要。

石蠟切片（paraffin section）技術被廣泛應用于細胞生物學、組織學、發育生物學和病理學等領域[5]，常應用于動、植物標本的組織形態學觀察、細胞結構學觀察、特定組織蛋白免疫組化、原位雜交及原位PCR 等，使細胞組織的形態觀察研究從簡單的形態結構深入到各種成分的定性觀察，又從定性轉向定量計測[6]。常規石蠟切片的制作過程包括石蠟組織塊制作、切片制作和染色，具體的制作過程是：取材→固定→沖洗→脫水→透明→浸蠟→包埋→切片→貼片→烤片→染色→封固。其中的每一個環節都是相互關聯，任何一個環節若不按規范操作，都會影響最終制片的質量[7]。然而，在眾多組織中，以高大喬木的木質部為材料制作石蠟切片尤為困難。筆者在總結前人研究的基礎上，通過長期的摸索，改進了常規石蠟切片制作方法，使得30齡的橡膠樹木質部組織也能被制作出高質量的切片。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

供試植物材料為3齡和30齡的橡膠樹品種PR107，由國家橡膠樹種質資源圃提供。分別選取距地面1 m處的樹干，各3次重復。

1.1.2 試劑及儀器

試劑包括切片石蠟、二甲苯、FAA固定劑、冰醋酸、80%乙醇、95%乙醇、100%乙醇、正丁醇、番紅染液、硝酸、鉻酸、結晶紫、樹膠等；主要儀器：LEICA RM2235切片機、LEICA DMLB顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 常規石蠟切片方法制作橡膠樹木質部切片[8-9]

在橡膠樹木材處（距離木材韌皮部3～5 cm）切取約0.5 cm×1 cm×1 cm（橫×弦×徑向）的樣品木材小塊 → FAA固定液固定 → 80%乙醇（1 h）→ 95%乙醇（1 h）→ 100%乙醇（1 h×3次）→二甲苯Ⅰ（1 h）→二甲苯Ⅱ（1 h）→二甲苯Ⅲ（1 h）→二甲苯/石蠟（V∶V=1∶1）（65℃，48～72 h）→石蠟Ⅰ（65℃滲蠟4 h）→ 石蠟Ⅱ（65℃，4 h）→石蠟Ⅲ（65℃，4 h）→包埋→切片（10 μm）→貼片→展片→番紅染色（30 min）→ 顯微觀察。

1.2.2 優化的石蠟切片方法制作橡膠樹木質部切片[10-12]

取材→固定液固定→80%乙醇（1 h）→ 95%乙醇（1 h）→ 100%乙醇（1 h×3次）→冰醋酸（36～48 h）→冰醋酸/無水乙醇（V∶V=1∶3，1 h）→無水乙醇（1 h×3次）→ 100%乙醇/正丁醇（V∶V=1∶1，1 h）→ 正丁醇Ⅰ（2 h）→正丁醇Ⅱ（2 h）→正丁醇Ⅲ（2 h）→正丁醇/石蠟（V∶V=1∶1，65℃，12～16 h），后續步驟與常規方法一致。

1.2.3 優化的石蠟切片制作方法有效性驗證

在橡膠樹木材（距離木材韌皮部3～5 cm）處切取1 cm×1 cm×1 cm（橫×弦×徑向）的樣品木材小塊；從樣品木材小塊上切下縱向1 cm長的火柴桿粗細的小棒，3次重復；采用硝酸離析法[13-15]對木質部纖維進行結構解剖，用0.10 kg/L鉻酸與10%（φ）硝酸（V∶V=1∶1）的混合液離析木材小棒4～5 d；離析后的材料經水清洗、系列乙醇脫水、0.01 kg/L的結晶紫染液染色、 二甲苯透明、樹膠封片后，在光學顯微鏡下觀察，拍照測量木纖維的長度與寬度。

2 結果與分析

2.1 2種方法的木質部切片結果比較

用常規的石蠟切片方法，無法獲得完整的3齡和30齡的橡膠樹木質部切片（圖1-A），主要表現在：（1）切片時，石蠟與木質部脫離；（2）木質部脫水后硬且脆，容易破碎；（3）脫蠟染色時，木質部發生卷曲、脫落。而優化的石蠟切片方法可以制作3齡幼樹和30齡老樹完整、高質量的木質部石蠟切片，能清晰觀察到細長的木纖維細胞以及緊密排列在四周的木射線細胞（圖1-B和圖1-C）。

2.2 優化法與硝酸離析所得木纖維比較

用硝酸離析后得到的木質部，經顯微觀測可清晰見到分散的木纖維細胞（圖1-D）。分別測量優化法和硝酸離析所得到木纖維的長度與寬度，通過DPS數據比較發現，優化的石蠟切片中9份實驗材料的木纖維長度均小于硝酸離析所得的木纖維長度，但二者差異不顯著（圖2），二者木纖維寬度的數據差異也極小（圖3）。

3 討論

橡膠樹木質部石蠟切片制作的質量直接關系到木纖維觀測的準確性，進而影響橡膠樹木材特性的研究。通過3齡和30齡的橡膠樹品種PR107木質部石蠟切片制作，結果發現，常規的植物石蠟切片方法不能用于制作橡膠樹木質部石蠟切片，因此，筆者對其進行了改進，主要包括：（1）增加醋酸軟化這一步驟，通過醋酸38 h的軟化，橡膠樹木質部組織變得松軟，容易浸蠟，利于順利完成切片，大大少于樹芯切片的軟化時間[于70%乙醇與甘油的混合液（V∶V=1∶1）中進行軟化，軟化時間需大于1周][16]；（2）用正丁醇取代二甲苯作為透明劑，二甲苯氣味難聞且有毒，用正丁醇替換既保證了實驗效果，同時比較環保，對人體傷害小；（3）優化了橡膠樹木質部組織脫水、軟化、透明和浸蠟等步驟的處理時間，使木質部石蠟制片的效果達到最佳。結果發現石蠟切片的木纖維長度均小于硝酸離析所得的木纖維長度，主要原因是石蠟切片中的木纖維相互交錯，起始點與終止點較難準確把握。本研究通過對常規石蠟切片方法的改進，制出完整、優質的橡膠樹木質部切片，不僅為橡膠樹成齡木材的解剖學研究提供了方法，同時也為其它高大喬木木質部的研究奠定了基礎。

參考文獻

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