碳納米材料在聚合酶鏈式反應中的研究進展

賈 靜（國家知識產權局專利局專利審查協作廣東中心,廣州510530）

碳納米材料在聚合酶鏈式反應中的研究進展

賈 靜
（國家知識產權局專利局專利審查協作廣東中心,廣州510530）

摘 要：聚合酶鏈式反應（PCR）是現代分子生物學的核心技術之一，提高PCR擴增效率具有重要意義，傳統方法具有眾多局限性。碳納米材料具有納米材料特殊的性質，易與生物大分子蛋白質、核酸相互作用，對PCR擴增效率的提高具有重要的應用價值和理論意義。

關鍵詞：聚合酶鏈式反應；碳納米材料；特異性

1 引言

聚合酶鏈式反應(PCR)能夠在體外擴增DNA，并能使微量的模板在數小時內以指數形式擴增數百萬倍。在實際運用中，PCR技術還存在如假陽性、假陰性、擴增效率低等問題。為解決上述問題，科學家們主要從三個方面進行嘗試和努力：一是調整PCR的參數，如調整聚合酶的種類或濃度、Mg2+濃度退火溫度等；二是引入不同類型的添加劑對PCR體系進行優化，比如甲酰胺、 二甲基亞砜、海藻糖[1-3]等；三是改進PCR擴增策略，如熱啟動PCR、巢式PCR、降落PCR等從傳統PCR衍生出的策略。

碳納米材料是指分散相尺度至少有一維小于100nm的碳材料。碳納米材料按形態主要包括四種類型：片狀（石墨烯），管狀（碳納米管），纖維狀（碳納米纖維）、球狀（納米碳球） 是目前應用非常廣泛的一類納米材料。碳納米材料能夠與生物分子發生復雜的相互作用，因此很多學者將碳納米材料引入PCR反應中，提高PCR反應的產量和特異性，拓展PCR技術的應用范圍。

2 碳納米材料在PCR中的應用

2.1 碳納米管在PCR中的應用

2004年，Cui等[4]發現單壁納米碳管(SWCNTs)可優化PCR反應。當PCR體系中的SWCNTs濃度低于3μg/μL時，產物的產量增加。SWCNTs的作用類似Mg2+，加入SWCNTs后即使反應液中無Mg2+，也不影響擴增。作者推測PCR各組分和SWCNTs充分接觸后發生作用，提高PCR的反應產物的產量。XPS表明PCR反應后SWCNTs的C1s結合能增加，證實在PCR反應中SWCNTs與DNA模板、Taq聚合酶發生了強烈的相互作用，SWCNTs與PCR各組分之間發生了電子轉移，SWCNTs的作用類似Mg2+，使Taq聚合酶保持高的反應活性。

2008年，Zhang等[5]研究了單壁碳納米管(SWCNTs)和多壁碳納米管(MWCNTs)對于Long PCR擴增特異性的影響。在PCR體系中添加不同管徑的SWCNTs 和MWCNTs，調節體系中碳納米管的濃度為0.8～1.6 mg/mL，擴增長度為14.3 kb 的DNA片斷，可以提高PCR反應的特異性和產率。作者認為PCR效率提高是因為碳納米管具有良好的導熱性，而不是與PCR組分相互作用的結果。

2.2 碳納米粉在PCR中的應用

2007年，Zhang等[6]將納米碳粉(CNP)的懸浮液加入PCR體系，提高了多輪PCR和Long PCR的特異性。加入CNP后，在第6輪擴增中得到單一的目標條帶。無CNP時，第4輪擴增開始出現非特異性條帶，第5輪擴增幾乎無目標條帶。在Long PCR中，CNP顯著減少非特異性條帶。原子力顯微鏡表明CNP與雙鏈DNA發生作用，

使引物和未完全退火的DNA結合在CNP上，阻止引物與DNA模板之間發生錯配，減少引物二聚體的產生。

2.3 石墨烯在PCR中的應用

2012年，米麗娟等[7]研究了氧化石墨烯（GO）在PCR中的應用，發現添加0.2-2.5ng/μL GO可顯著提高PCR的特異性和擴增產量，添加1ng/μL GO時，產量的提升尤為顯著，產率達對照組的250%。在模板來源不同、濃度不同的PCR體系中分別加入 GO，發現添加GO的實驗組靈敏度提高了1-3個數量級，并顯著消除了引物二聚體，證明GO適用于各種濃度和復雜程度的DNA模板，甚至在模板量低于102拷貝數時也適用。

2012年，我們[8]研究了氧化石墨烯（GO）和還原石墨烯（rGO）對于多輪PCR反應特異性的影響。在兩輪PCR中，GO的終濃度介于12-60μg/mL時明顯提高第一輪PCR產物的特異性；以第一輪擴增產物為模板進行第二輪擴增，GO在上述濃度內無法提高PCR產物的特異性。然而，rGO在兩輪PCR中，終濃度為10-12μg/mL時顯著提高了PCR產物的特異性。此外，利用9輪PCR證實RGO對PCR特異性的影響，各輪PCR中加入12μg/mL rGO，對照組從第4輪開始已基本得不到產物，實驗組甚至在8輪PCR反應后依然能夠得到產物。還證實降低退火溫度至25℃的情況下，加入rGO的PCR體系依然得到清晰的產物帶。我們認為主要是石墨烯與pfu聚合酶的相互作用，負電位較弱的rGO與pfu聚合酶形成帶正電的復合物，吸引帶負電的DNA模板和引物到rGO的表面發生退火和延伸，降低非特異性反應的發生。

3 總結與展望

將納米材料引入PCR反應提高了PCR反應的特異性和產量，拓寬了PCR技術的應用范圍。今后，則要嘗試解決長片段、GC富集模板等復雜體系的擴增問題，并在RT-PCR等相關技術中促進納米碳材料的輔助應用。

參考文獻：

[1]G.Sarkar, et al．Nucleic Acids Res., 1990(18):7465．

[2]P.R.Winship．Nucleic Acids Res., 1989(17):1266．

[3]A.N.Spiess,et al．Clinical Chemistry,2004(50):1256-1259.

[4]D.X.Cui, et al. Nanotechnology, 2004(15):154-157．

[5]Z.Z.Zhang, et al. BioTechniques, 2008(44):537-545．

[6]Z.Z.Zhang,et al. Nanotechnology, 200(l8):355706．

[7]米麗娟等. CN102465163A, 2012-05-23.

[8]Jing Jia, et al. Small, 2012(08):2011-2015.