姜黃素對胰腺癌細胞PANC—1體外侵襲轉移的影響

陳龍佩等

[摘 要] 目的：探討姜黃素對胰腺癌PANC-1細胞侵襲轉移的影響。方法：以10μmol/mL、 20μmol/mL、30μmol/mL和60 μmol/mL姜黃素處理胰腺癌PANC-1細胞，MTT 法檢測其對PANC-1細胞的生長和抑制作用。應用Transwell小室進行人工重組基底膜（Matrigel）侵襲和運動實驗，觀察姜黃素對PANC-1細胞侵襲和轉移的影響。結果：應用姜黃素處理后胰腺癌細胞生長受到抑制且作用呈時效、量效依賴關系；非致死濃度姜黃素處理后胰腺癌PANC-1細胞侵襲和轉移明顯降低。結論：姜黃素能夠減弱胰腺癌細胞PANC-1的侵襲和轉移。

[關鍵詞] 胰腺癌；姜黃素；侵襲；轉移

中圖分類號：R 735.9 文獻標識碼： A 文章編號：2095-5200（2015）04-001-03

[Abstract] Objective： To explore the effects of curcumin on invasion and metastasis of the human pancreatic cancer cells PANC-1. Method： PANC-1 were treated with 10， 20，30 and 60μmol/ml curcumin，respectively. Proliferation of PANC-1 cells was measured with MTT assay. Invasion and metastasis of PANC-1 cells were evaluated with Transwell chamber. Result： After being treated with curcumin， the proliferation of Pancreatic cells was inhibited in a time and dose-depending manner. The invasion and metastasis of Pancreatic cells were also inhibited. Conclusion： Curcumin could restrain the invasion and metastasis of the human pancreatic cancer cells PANC-1.

[Key words] pancreatic cancer；curcumin；invasion；metastasis

胰腺癌是較常見的消化系惡性腫瘤，該疾病的早期診斷十分困難，多數新發病例已存在周圍器官侵犯和/或遠處轉移 [1]。因此，探索有效的抗胰腺癌藥物對降低胰腺癌死亡率極其重要。近年來，研究發現姜黃素（curcumin）具有較強的抗炎、抗氧化和抗腫瘤特性[2-6]。但姜黃素對胰腺癌細胞侵襲轉移能力的影響尚未明確。本研究擬探討姜黃素對胰腺癌PANC-1細胞體外侵襲和轉移的影響，為姜黃素的進一步應用提供實驗借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

細胞株及實驗試劑人胰腺癌細胞系PANC-1購自上海細胞生物學研究所，細胞培養采用含10%胎牛血清（杭州四季青生物有限公司）的DMEM（賽默飛世爾生物化學制品有限公司）高糖培養基（ 內含1%的青霉素和鏈霉素） 。姜黃素、四甲基偶氮唑藍（ MTT） 購于Sigma 公司。Transwell小室及聚碳酸酯購自Corning公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及處理 胰腺癌PANC-1細胞培養于含10%FBS的DMEM高糖培養基中，置于37℃，5% CO2潮濕空氣的培養箱中培養， 每48 h換液傳代1次，倍增時間約24 h。取2代生長良好，細胞活性大于98%的細胞進行實驗。用不同濃度的姜黃素（10μmol/mL、 20μmol/mL、30μmol/mL和60 μmol/mL）作用后收集細胞進行相關檢測。

1.2.2 MTT法（比色實驗）測定細胞增殖 取對數生長期的PANC-1細胞，調整細胞濃度為2×104個/mL。取3塊96孔培養板每孔接種細胞懸液200μL，設未加藥細胞組、姜黃素組（設10 μmol/mL、20 μmol/mL、30 μmol/mL、60 μmol/mL 4個濃度于細胞80%處于融合狀態后加藥），每組設5個平行孔。置37 ℃、體積分數5%CO2飽和濕度孵箱內培養。分別培養24h、48h和72 h后棄上清，每孔加入MTT 20μL（5 mg/mL）及無血清DMEM 200 μL繼續培養4 h， 取出后2 000 r/min（r =15 cm）離心10 min，棄上清，每孔加200 μL DMSO 震蕩10 min，用酶標儀測定波長570 nm 的吸光值（A）。實驗重復3次，取平均值。計算藥物在不同濃度、不同作用時間對PANC-1細胞的抑制率。細胞生長抑制率=1-（ A實驗組-A空白） /（ A對照組-A空白） ×100%。

1.2.3 Transwell小室檢測細胞體外侵襲能力 在Transwell小室上下室之間置8μm聚碳酸醋濾膜，上室底部涂上Matrigel 50μg/孔（Matrigel：serum-free DMEM=1：3）后，置于37 ℃，5% CO2潮濕空氣的培養箱中24h，取出制膠完成的Transwell侵襲小室。因20μmol/mL姜黃素處理后細胞活力與10μmol/mL沒有顯著的差別，為證明姜黃素對胰腺癌PANC-1具有劑量-效應關系，故選用10μmol/mL的姜黃素濃度與30μmol/mL的姜黃素濃度處理后進行比較；而60μmol/mL的姜黃素濃度處理后胰腺癌PANC-1本身的抑制率已經超過50%。Transwll實驗結果是累計數目的結果，24h后一般細胞還有可以穿透膠的活力，而超過48h后PANC-1細胞活力大部分喪失。侵襲實驗與細胞本身活力有關，故一般超過20%致死率濃度不采用，超過48h的時間點不采用。因此取對照組和實驗組10μmol/mL、30μmol/mL濃度姜黃素處理48h細胞，消化離心后調整細胞密度為3× 105個/mL，分別取200 μL接種至上室，置于24孔板內，同時在下室中加入含10% FBS的DMEM高糖培養基600 μL，培養48 h后，取出小室，用棉簽頭擦掉 Matrigel膠，PBS液洗3次，800 μL的冰凍甲醇中固定。常規甲紫染色，完整取下小室膜反面貼在載玻片上。結果判定：200 倍光鏡下，計數每膜5個隨機不同視野的穿膜細胞數，取均值，每組平行設3個小室。實驗重復3次。

1.2.4 統計處理 計量數據資料用x±s 表示，用t檢驗和方差分析。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 姜黃素對胰腺癌PANC-1細胞增殖能力的影響

分別采用10μmol/mL、 20μmol/mL、30μmol/mL和60 μmol/mL的姜黃素濃度處理胰腺癌PANC-1細胞。結果顯示姜黃素對胰腺癌PANC-1細胞增殖有抑制作用，差異具有統計學意義（P<0.05），見表1。并隨時間延長和藥物濃度加大而增強，即呈時效、量效依賴關系（P<0.05），見圖1。

2.2 Transwell侵襲實驗

如下圖所示， 10μmol/mL姜黃素處理組（B組）、30μmol/mL姜黃素處理組（C組），PANC-1細胞穿過侵襲小室的侵襲細胞數與對照組（A組）侵襲細胞數相比較，較高濃度的姜黃素處理后的胰腺癌PANC-1細胞穿過的數目明顯減少（A組穿透細胞數約：300；B組穿透細胞數約：237；C組穿透細胞數約：132），差異有統計學意義（P<0.05）。

3 討論

胰腺癌具有惡性程度高、進展快、轉移早、預后差等特點，號稱“癌中之王”。雖然近年來胰腺癌的發病率和死亡率在緩慢下降，但胰腺癌仍是癌癥相關死亡的第四大原因。目前胰腺癌的5年生存率僅為4%，而1年生存率也只有21%[7]，主要原因為大多數患者就診時已經發生了遠處轉移。因此，抑制胰腺癌侵襲轉移的治療策略一直是腫瘤研究的熱點。近年來，癌癥的多學科綜合治療得到了極大發展。我國傳統醫藥在腫瘤治療中地位愈發受到重視。姜黃素已被證實對包括乳腺癌、胃癌、結腸癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌等多種腫瘤細胞具有抑制作用 [8-10]。但姜黃素對PANC-1細胞侵襲的影響至今尚未有文獻報道，本研究采用Transwell方法探討姜黃素在體外對PANC-1細胞侵襲能力的影響。我們的實驗結果表明，姜黃素可抑制胰腺癌細胞增殖、生存，并證實了姜黃素對抑制胰腺癌PANC-1細胞的增殖具有時效、量效的關系，這與既往研究結果相一致[11-12]。為排除藥物對細胞活性的影響，本次實驗采用了低于20%的非致死濃度姜黃素處理PANC-1細胞，觀察藥物處理前后細胞侵襲能力的變化。腫瘤細胞分泌蛋白降解酶等降解細胞外基質是腫瘤細胞侵襲轉移的重要步驟，侵襲小室實驗即模擬了細胞外基質的環境，降解基質的腫瘤細胞要得以從低營養培養基遷移至高營養培養基中，通過檢測穿過膜的細胞數可間接反映腫瘤細胞侵襲能力。本實驗結果表明，姜黃素可顯著抑制PANC-1細胞侵襲能力，有望用于抗PANC-1治療，但其具體作用機制尚需進一步實驗證明。在本實驗基礎上，可考慮在后續研究中探討姜黃素在胰腺癌的動物模型中作用，觀測其對轉移、侵襲相關基因或信號通路影響，進一步揭示姜黃素抑制PANC-1細胞的機制，為胰腺癌綜合治療提供新思路。

參 考 文 獻

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