超高效液相色譜—串聯質譜法同時測定葡萄中8種植物生長調節劑的殘留量

王遠　邢麗杰　向曉黎等

摘要

[目的]建立超高效液相色譜串聯質譜法（UPLCMS/MS）同時測定葡萄中8種植物生長調節劑殘留量的方法。[方法]將供試葡萄樣品經乙腈提取，分散固相萃取，采用BEH C18色譜柱分離，以乙腈和水為流動相進行梯度洗脫。采用電噴霧離子化，正負離子分段掃描和多反應監測模式（MRM）檢測，外標法定量。[結果]試驗得出，縮節胺、矮壯素、赤霉素在2.5 ～500 ng/ml，6芐氨基嘌呤、對氯苯氧乙酸、氯吡脲、多效唑、2，4二氯苯氧乙酸在1～200 ng/ml范圍內線性關系良好，相關系數均大于0.990。8種植物生長調節劑的方法檢出限為0.2～0.5 μg/kg，方法定量限為0.5～1.5 μg/kg，樣品添加回收試驗的平均回收率為73.5%～102.2%，相對標準偏差為2.9%～9.7%（n=7）。[結論]該方法簡單、靈敏度高、分析時間短，適用于葡萄中8植物生長調節劑的測定。

關鍵詞 超高效液相色譜-串聯質譜；植物生長調節劑；殘留；葡萄

中圖分類號 S481+.8；O657.63 文獻標識碼

A 文章編號 0517-6611（2015）15-247-05

Determination of 8 Plant Growth Regulator Residues in Grape by UPLCMS/MS

WANG Yuan，XING Lijie，XIANG Xiaoli et al

（Food Quality Supervision and Testing Center of Ministry of Agriculture，Xinjiang Academy of Agricultural Reclamation Science，Shihezi，Xinjiang 832000）

Abstract [Objective] A method was established for determining 8 plant growth regulator residues in grapes by ultra performance liquid chromatographytandem mass spectrometry（UPLCMS/MS）.[Method] Samples were extracted with acetonitrile，and cleaned up dispersivesolid phase extraction.The target analytes were separated on a BEH C18 column with gradient elution using a mobile phase made up of acetonitrile and water.The samples were detected under positive and negative multiple reactions monitoring（MRM） mode through polarity switching between time segments.[Result] The linearities of mepiquat chloride，chlormequat chloride and gibberellic acid were in the concentration range of 2.5-500 ng/ml， 6benzylaminopurine，4chlorophenoxyaceticacid，forchlorfenuron，paclobutrazol and 2，4dichlorophenoxyacetic were in the concentration range of 1-200 ng/ml，with the correlation coefficients higher than 0.990.The limits of detection（LOD） and the limits of quantitation（LOQ） of the method were 0.2-0.5 μg/kg and 0.5-1.5 μg/kg.The average spiked recovery rates were in the range of 73.5%-102.2%.The relative standard deviation（RSD，n=7） was 2.9%-9.7%.[Conclusion] The method proved to be simple，sensitive，rapid and suitable for the determination of 8 plant growth regulator residues in grapes.

Key words Ultra performance liquid chromatographytandem mass spectrometry（UPLCMS/MS）； Plant growth regulator； Residue； Grape

植物生長調節劑（Plant growth regulator，PGRs）是一種能促進植物生長、提高作物產品質量和品質的一類植物激素[1]。植物生長調節劑可分為植物生長促進劑、延緩劑和抑制劑3大類。目前，生產上廣泛使用的類別有生長素類（吲哚3乙酸、吲哚3丁酸、α萘乙酸、2，4二氯苯氧乙酸、對氯苯氧乙酸和對氟苯氧乙酸）、細胞分裂素類（異戊烯腺嘌呤、氯吡脲和6芐氨基嘌呤）和赤霉素類等[2]。近年來，由于植物生長調節劑使用不當引起的食品安全問題逐漸增多，植物生長調節劑在農作物中的殘留可通過食物鏈進入人體，輕者造成腹瀉等疾病，重者使人體免疫力下降，骨骼疏松，甚至有致畸、致癌、致突變等嚴重后果[3]。

美國、歐盟、澳大利亞、加拿大和日本相繼對常用植物生長調節劑的一種或幾種制定了最高殘留限量（MRLs）。我國對于植物生長調節劑的規定相對較少，國家標準GB 2763中涉及到常用植物生長調節劑有2，4二氯苯氧乙酸、矮壯素、多效唑和氯吡脲，但是對葡萄中殘留限量作規定只有2，4二氯苯氧乙酸和氯吡脲，最高殘留限量均為005 mg/kg[4]。

目前對于常用植物生長調節劑殘留的研究主要包括：高效液相色譜法[5-6]、氣質聯用法[7-8]和液質聯用法[9-14]。液相色譜法由于抗干擾能力差，存在一定的假陽性；氣質聯用前處理較為復雜，檢測時間較長；液質聯用法對于物質的分析從結構上進行確認，大大降低了假陽性，同時前處理方法簡單、時間短，適用于多組分快速檢測。新疆是我國主要的葡萄產區，但是在葡萄中植物生長調節劑限量制定方面還不完善，因此，建立葡萄中常用植物生長調節劑殘留量的檢測方法尤為重要。該研究主要集中在葡萄中常使用的8種植物生長調節劑，采用超高效液相色譜-串聯質譜技術，正負離子同時切換測定葡萄中8種植物生長調節劑的殘留量，該方法操作簡便、靈敏度高，可滿足同時對葡萄中多種植物生長調節劑殘留進行定性及定量分析的要求。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料與試劑。

乙腈 （HPLC級），德國MERCK公司；甲醇（HPLC級），德國CNW公司；N丙基乙二胺吸附劑（PSA），上海安譜科學儀器有限公司；無水硫酸鎂、氯化鈉、乙酸乙酯，均為分析純。所用水為超純水。8種植物生長調節劑標準品：赤霉素（gibberellic acid，GA3）、6芐氨基嘌呤（6benzylaminopurine，6BA）、對氯苯氧乙酸（4chlorophenoxyaceticacid 4CPA）、氯吡脲（forchlorfenuron）、多效唑（paclobutrazol）、2，4二氯苯氧乙酸（2，4dichlorophenoxyacetic）、縮節胺（mepiquat chloride）、矮壯素（chlormequat chloride），純度均大于96%，德國Dr.Ehrenstorfer。

1.1.2 主要儀器與設備。

Waters Xevo TQMS 液質聯用儀，美國Waters公司；勻漿機，德國IKA公司；氮吹儀，美國Organomation公司；高速冷凍離心機，德國Sigma公司；超聲儀KQ600DE，江蘇昆山市超聲儀器公司；超純水儀，成都超純科技有限公司。

1.2 儀器參數

1.2.1 色譜條件 。

BEH C18色譜柱（2.1×100 mm，粒徑1.7 μm），柱溫30 ℃，進樣體積5 μl，流動相為水-乙腈（梯度洗脫），流速為0.4 ml/min。

1.2.2 質譜條件。

電噴霧離子源，正離子/負離子電離（ESI+/ESI），脫溶劑氣800 L/h，干燥氣溫度400 ℃，錐孔氣50 L/h，離子源溫度150 ℃，在分析過程中，以離子對（1母離子和2個子離子）信息比較進行定性分析；以母離子和響應值最高的子離子進行定量分析。8種植物生長調節劑在多反應監測模式下質譜參數見表1。

1.3 樣品處理

稱取5.0 g（精確至0.01 g）葡萄樣品于50 ml離心管中，加入20 ml乙腈，勻漿1 min，超聲提取5 min，再加入2 g氯化鈉，渦旋后離心，取乙腈層，待凈化。將400 mg無水硫酸鎂和100 mg PSA加入上述提取液中，渦旋1 min，離心后準確移取10 ml上清液至試管中，45 ℃下氮吹至近干，加入1 ml乙腈水溶液（乙腈∶水=2∶8）溶解，渦旋混勻，經022 μm濾膜后，在UPLCMS/MS上測定。

1.4 標準曲線及檢出限

8種植物生長調節劑標準溶液的配制：分別精密稱取8種植物生長調節劑標準品適量，置于10 ml棕色容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋成濃度為1.00 mg/ml的標準儲備液，量取標準儲備液適量，再逐步稀釋成工作液。在選定的色譜條件和質譜條件下測定，以進樣濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，進行線性回歸計算，分別得到8種植物生長調節劑的線性方程和相關系數。計算3倍信噪時所對應的樣品濃度，作為方法的檢出限，10倍信噪時所對應的樣品濃度，作為方法的定量限。

1.5 方法回收率及精密度試驗

采用對陰性樣品進行加標回收試驗來考察方法的準確度和精密度，即對本底不含植物生長調節劑的陰性葡萄樣品，分別添加3個水平的8種植物生長調節劑標準溶液，按照“1.3”項下進行樣品前處理，在“1.2.1”項下的色譜條件和“1.2.2”項下的質譜條件下測定，計算樣品加標回收率。每個添加水平連續重復進樣7 次，測得各組分的峰面積，計算其相對標準偏差（RSD）。

2 結果與分析

2.1 提取條件的選擇

比較了乙腈、甲醇、乙酸乙酯作為提取溶劑對葡萄中8種植物生長調節劑的提取效率，結果發現，乙腈和甲醇對8種植物生長調節劑的提取效率要高于乙酸乙酯，由于樣品本身中含有大量水分，甲醇作為提取劑，在濃縮之前要用大量除水劑除去樣品中的水分，而乙腈作為提取劑只需要在提取后加入少量的氯化鈉，就可以使乙腈和水相分離，因此選乙腈經作為提取溶劑。

2.2 色譜條件的選擇

首先比較了甲醇和乙腈分別作為有機流動相，結果表明，甲醇和乙腈的洗脫能力都比較良好，使用乙腈時，靈敏度要高于甲醇，這是由于甲醇會使離子化受到不同程度的抑制。其次比較了水相中加甲酸和不加甲酸，結果表明，不加甲酸時，靈敏度要明顯高于加甲酸，是由于在正負離子同時檢測時，加入甲酸會影響負離子模式的離子化效率。最后比較了定容液的組成對各個組分的影響，由于甲酸對負離子的離子化有抑制的作用，所以選擇乙腈水體系作為定容液，同時比較了乙腈水體系中乙腈和水的組成比例（乙腈和水體積比分別為1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1）對各個組分的影響，結果發現當乙腈和水體積比為2∶8時，各組分達到最大響應值。故選擇乙腈和水體積比為2∶8作為最后上機定容溶液。

2.3 線性相關性

采用外標法定量，在上述儀器條件下進行測定，以MS/MS定量離子色譜峰面積（y）對濃度（x）繪制標準曲線，并求出相應的線性回歸方程及相關系數。8種植物生長調節劑在相應的濃度范圍內具有良好的線性關系，相關系數r均在0.99以上。按3倍信噪比和10倍信噪比計算分別得到8種植物生長調節劑的檢出限和定量限，結果見表2。8種植物生長調節劑的檢出限為0.2～0.5 μg/kg，定量限為0.5～1.5 μg/kg。8種生長調節劑標準品總離子流見圖1，加標總離子流見圖2。

2.4 方法的準確度和精密度

按照“1.5”方法進行回收率和精密度試驗（表3），計算加標回收率和相對標準偏差。由表3中的回收率和RSD數據可以看出，樣品在3個添加水平下8種植物生長調節劑的回收率處于73.5%～102.2%，相對標準偏差2.9%～9.7%。上述結果表明，運用該方法得到的數據是準確可靠的。結合前面所述的方法檢出限低的特點可知，該方法能夠從根本上消除檢測結果出現假陰性的可能性。

2.5 實際樣品的測定 利用該方法對新疆維吾爾自治區3個批次20個葡萄樣品進行了檢測，其中葡萄中檢出氯吡脲、2，4二氯苯氧乙酸、多效唑、矮壯素，含量在2～10 μg/kg范圍內，其他均未檢出，方法適用性良好。8種生長調節劑實際樣品總離子流圖見圖3。

3 結論

該試驗通過對提取條件和質譜條件的優化，建立了超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定葡萄中8種植物生長調節劑殘留量的方法。該方法前處理簡單、靈敏度高，線性關系、準確度和精密度良好，能滿足葡萄中8種植物生長調節劑殘留限量要求，方法適應性良好。

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