副豬嗜血桿菌云南流行毒株的分離與鑒定

陳關(guān)雄　姜學云　臺曉媛等

摘要 [目的] 了解云南省副豬嗜血桿菌流行毒株的生化特性。[方法] 采集10頭6月齡疑似豬傳染性副豬嗜血桿菌病的病豬樣品， 用巧克力培養(yǎng)基進行細菌的分離與培養(yǎng)，并對分離菌株進行細菌的形態(tài)觀察、培養(yǎng)特性和生化試驗鑒定。[結(jié)果] 成功分離出1株副豬嗜血桿菌，該分離株不需要X因子，但需要V因子。分離菌株被鑒定為副豬嗜血桿菌，從而將此病例確診為副豬嗜血桿菌病。[結(jié)論] 該研究可為進一步控制副豬嗜血桿菌的危害奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 副豬嗜血桿菌；分離；鑒定；生化特性

中圖分類號 S858.28 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2015）15-159-02

Isolation and Identification of Epidemic Strains of Swine Heamophilus parasuis in Yunnan Province

CHEN Guanxiong1，JIANG Xueyun2，TAI Xiaoyuan3，ZHU Lingyun5* et al

（1. Animal Husbandry and Veterinary Station in Shilin County of Yunnan Province， Shilin， Yunan 652200； 2. Comprehensive Agricultural Service Center of Xijiekou Town in Shilin County of Yunnan Province， Shilin， Yunan 652209； 3. Comprehensive Agricultural Service Center in Dake Township of Shilin County，Yunnan Province，Shilin，Yunan 652202；5. College of Animal Science and Technology， Yunnan Agricultural University， Kunming， Yunan 650201）

Abstract [Objective] The research aimed to understand the biochemical characteristics of epidemic strains of swine Heamophilus parasuis in Yunnan Province. [Method] The diseased samples were collected 10 heads of suspected swine infected with H. parasuis. The pathogen was isolated and cultured with chocolate medium. And the isolated strain was identified by using morphologic observation， culture characteristics and biochemical tests. [Result] One strain of H. parasuis was successfully isolated. This isolated strain didnt need X factor， but it needed V factor. [Conclusion] The research laid the foundation for controlling the damage of H. parasuis further.

Key words Heamophilus parasuis；Isolation； Identification；Biochemical characteristics

副豬嗜血桿菌病（Haemophilus parasuis，Hps）又稱為豬革拉斯氏?。℅lassers disease），常引起豬的多發(fā)性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎，曾被認為是由應激所引起的散發(fā)性疾病，后來被證實是由副豬嗜血桿菌所引起[1]。副豬嗜血桿菌可以影響從2周齡到4月齡的青年豬，主要在斷奶后和保育階段發(fā)病，通常見于5～8周齡的豬，發(fā)病率一般為10%～15%，嚴重時死亡率可達50%[2]。

隨著世界養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，該病已成為全球范圍內(nèi)影響?zhàn)B豬業(yè)的典型細菌性疾病[3]。在我國，由于飼養(yǎng)技術(shù)的調(diào)整不當以及突發(fā)新的呼吸道綜合征，使得該病日趨流行，危害日漸嚴重。近年來，我國各豬場發(fā)生多發(fā)性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎的報道屢見不鮮，其中不少病例的病原被初步診斷為副豬嗜血桿菌，但限于生產(chǎn)條件，極少有人對其進行確切診斷，因此有必要對其進行實驗室研究，確定其生物特性。

筆者從具有典型臨床癥狀的病豬的肺臟心包積液和關(guān)節(jié)液等病料中取樣，采用常規(guī)細菌分離培養(yǎng)方法進行分離培養(yǎng)，對分離菌株進行生化鑒定，旨在為進一步研究副豬嗜血桿菌的形態(tài)特性、臨床診斷和預防疫苗研究等奠定基礎(chǔ)和實驗室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源。選擇云南省10只6周齡出現(xiàn)發(fā)熱、咳嗽、呼吸困難、跛行、消瘦的病豬進行試驗。

1.1.2 主要試劑。鮮血瓊脂、巧克力瓊脂、營養(yǎng)瓊脂、牛肉浸液、豬胃浸液、胎牛血清、NAD、氯化鈉、蛋白胨、瓊脂粉、葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、菊糖、果糖、麥芽糖、鼠李糖、多價蛋白胨、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、尿素、VP試劑和MR試劑等，均由動物醫(yī)學實驗室教學中心提供。

1.1.3 主要儀器。恒溫培養(yǎng)箱、高壓蒸汽消毒器、超凈工作臺、雙重純水蒸餾器等均由云南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學實驗室教學中心提供。

1.2 方法

1.2.1 病料內(nèi)細菌的分離培養(yǎng)。采用直接分離培養(yǎng)法，將病料在巧克力瓊脂培養(yǎng)基上涂抹后，進行常規(guī)劃線分離，置于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)24～48 h，挑取可疑菌落作純培養(yǎng)；挑取培養(yǎng)物到普通瓊脂上，觀察是否生長[4]。

1.2.2 生化試驗。

1.2.2.1 V因子試驗?？梢删浣臃N到加有V因子和未加V因子的馬丁肉湯培養(yǎng)基上，置于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)24～48 h，觀察是否長出菌落。

1.2.2.2 X因子試驗。挑取可疑菌落接種血瓊脂平板上，再用金黃色葡萄球菌在分離菌株劃線中間點4個點，置于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h后，觀察菌落長勢、葡萄球菌的溶血圈大小以及有無衛(wèi)星現(xiàn)象。

1.2.2.3 糖發(fā)酵試驗。分離菌株接種于葡萄糖、麥芽糖、果糖、半乳糖、鼠李糖、乳糖、蔗糖、菊糖和尿素等發(fā)酵管中，置于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h后，觀察發(fā)酵管顏色變化。

1.2.2.4 MR試驗。分離菌株接種于甲基紅培養(yǎng)基（培養(yǎng)基中加有NAD血清、牛肉浸液、豬胃浸液）中，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，滴加甲基紅指示劑2滴，觀察反應結(jié)果。若出現(xiàn)玫瑰紅色反應則為陽性，若出現(xiàn)黃色或不變色則為陰性。

1.2.2.5 VP試驗。按照Barritt氏法，將分離菌株接種到葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基（培養(yǎng)基中加有NAD血清、牛肉浸液、豬胃浸液）中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24～48 h。按照甲液（6% α萘酚乙醇/ml）∶乙液（40% 氫氧化鉀）=3∶1，混合后37 ℃水浴30 min觀察結(jié)果。若呈紅色則為陽性反應；若為陰性應繼續(xù)水浴4 h再進行觀察，若仍為陰性則判為陰性。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離培養(yǎng) 經(jīng)過培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，巧克力培養(yǎng)基上長出形態(tài)不同的3種菌落，其中1種菌落形態(tài)與副豬嗜血桿菌菌落形態(tài)相似，在營養(yǎng)瓊脂和血瓊脂上無法找到，該菌落呈圓形，表面光滑，邊緣整齊、灰白色、大頭針針帽大?。▓D1）。經(jīng)過查閱資料和染色鏡檢，發(fā)現(xiàn)它符合副豬嗜血桿菌的形態(tài)和染色特征[5]。

2.2 分離菌株的鏡檢及染色結(jié)果 經(jīng)革蘭染色可見到革蘭陰性細小桿菌，細菌為細絲狀，多單個存在，個別呈兩極濃染的球桿狀，中間有長而彎曲的絲狀菌體，菌體形態(tài)表現(xiàn)明顯的多形性[6-8]（圖2）。

2.3 生化鑒定結(jié)果

2.3.1 V因子試驗。經(jīng)過培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，接種加有V因子的馬丁肉湯培養(yǎng)基經(jīng)過培養(yǎng)上長出圓形、表面光滑、邊緣整齊、淺黃色、大頭針鎮(zhèn)帽大小的菌落。

2.3.2 X因子試驗。將分離菌株劃線于血瓊脂上，并在線條間點劃葡萄球菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)越靠近葡萄球菌分離菌株長出的菌落越多，且葡萄球菌的溶血圈進一步放大（衛(wèi)星現(xiàn)象）（圖3）。

2.3.2 生化特性。由表1可知，分離菌株能利用葡萄糖、乳糖，半乳糖，不能利用蔗糖、 鼠李糖、菊糖、果糖和尿素等，需要V因子，不需要X因子，MR和VP試驗結(jié)果均呈陰性。

3 討論

筆者從患病豬肺中成功分離到1株副豬嗜血桿菌，該菌株不需要X因子，但需要V因子。分離結(jié)果與以前報道的副豬嗜血桿菌在鼻腔和氣管中分離率較高[9-11]，肺臟中極少分離到這一結(jié)論不相符，可能是因為該研究是從具有典型病理變化的肺臟中分離的，該肺臟遭到副豬嗜血桿菌嚴重感染，肺臟中副豬嗜血桿菌數(shù)量較多。據(jù)此推斷，具有典型病變的肺臟也可以作為該病原的分離培養(yǎng)病料。

副豬嗜血桿菌及其脆弱，容易死亡，該菌在4 ℃只能存活1周，至多存活20 d。因此，即使通過病料送檢以PCR方法檢測出該菌的特異DNA片段，仍無法獲得具有生物活性的菌株，對該病的研究造成物質(zhì)上的困難[12-15]。該試驗分離的此菌株可以考慮具有典型病變肺臟作為材料。

疫苗的使用是預防副豬嗜血桿菌病最為有效的方法之一，但由于副豬嗜血桿菌具有明顯的地方性特征，而且不同血清型菌株之間的交叉保護率很低，因此用地方菌株制備滅活苗可以有效控制副豬嗜血桿菌病的發(fā)生[14]，為進一步控制副豬嗜血桿菌的危害和提高養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟效益提供支持。

參考文獻

[1] 薛國聰，徐成剛，涂玉蓉，等.副豬嗜血桿菌的分離鑒定與藥敏試驗[J].中國畜牧獸醫(yī)，2010，37（1）：134-137.

[2] 車勇良，江斌，吳學敏，等.福建地區(qū)副豬嗜血桿菌的主要生物學特性[J].中國獸醫(yī)科學，2012，42（12）：1237-1241.

[3] 陸承平.獸醫(yī)微生物學[M].4版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2007.

[4] 陳溥言.獸醫(yī)傳染病學[M].5版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2006.

[5] 蔡旭旺.副豬嗜血桿菌的分離鑒定及診斷方法與滅活疫苗的研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學，2010.