預混指示劑的PCR系統使用與評測

金磊

摘要[目的]研究預混系統對于PCR以及其下游試驗是否會產生影響。 [方法]采用“dye”及“density”預混的PCR系統與正常PCR系統進行PCR以及下游試驗，使用瓊脂糖凝膠電泳及NanoDrop2000檢測。[結果]預混系統與正常系統對于PCR產物的特異性以及質量未見明顯差別。[結論]預混系統也完全適合于下游的轉化、連接、酶切試驗。

關鍵詞PCR；預混系統；正常系統

中圖分類號S188文獻標識碼

A文章編號0517-6611（2015）07-021-02

聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction， PCR）是體外擴增特異性DNA片段的技術，是DNA重組技術的一次飛躍。近30年間出現許多衍生的PCR技術，如多重PCR、PCR單鏈構象多態性、實時熒光定量PCR技術，這些技術大大促進了分子克隆的發展，尤其是實時熒光定量PCR技術的發展結合蛋白質定量分析，為研究基因表達及相關蛋白質功能分析提供了有力手段[1-2]。實時熒光定量PCR系統將染色劑SYBR Green I 預混在PCR系統中進行PCR反應，SYBR Green I與雙鏈DNA結合而激發熒光的特性來定量檢測[3]。在PCR系統中預混指示劑、聚蔗糖等使得PCR反應完畢后可直接上樣檢測，使用方便，但對于PCR下游的分子克隆如連接、酶切是否會產生影響尚不明確。筆者使用預混“dye”及“density”的PCR系統（以下簡稱預混系統）進行PCR以及下游的連接、酶切試驗進行驗證，正常PCR系統（以下簡稱正常系統）作為參照，研究預混系統對于PCR以及其下游試驗是否會產生影響。

1材料與方法

1.1主要試劑

DNA ladder、限制性內切酶（Hind Ш、Nco I）、T4 DNA連接酶購買于NEB公司，PCR Master Max、p-EGMT載體瓊脂糖購買于promega公司，Green PCR Master Max購買于Thermo scientific公司，LB培養基、LB瓊脂均購自Invitrogen公司，PCR純化試劑盒、柱式質粒DNA提取試劑盒、特異性引物購買于生工（上海）生物工程有限公司。

載體與菌株：pGEM-T載體、大腸桿菌JM101為徐州醫學院醫學生物化學與分子生物學教學實驗中心保存。

1.2試驗方法

1.2.1PCR反應。50 μl PCR體系：質粒1 μl，2xPCR Master Mix 25 μl，上下游引物各5 μl，無核酶水14 μl。反應條件：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，25個循環；最后72 ℃延伸5 min。

1.2.2PCR產物純化。使用生工（上海）生物工程有限公司的柱式PCR產物純化試劑盒，標準操作步驟參見操作手冊。

1.2.3連接。取1 μl PCR純化產物加入含有p-EGMT載體以及T4 DNA連接酶的體系，16 ℃ 水浴連接4 h。

1.2.4轉化。取5 μl連接產物，將連接產物加入100 Ul感受態細胞JM101中，冰浴30 min，立即轉入42 ℃水浴1 min，然后再轉移至冰浴2 min，加入300 μl LB，37 ℃培養1 h后取50 μl涂布于準備好的含有氨芐青霉素的平板，倒置于37 ℃ 培養箱過夜培養。

1.2.5酶切。取10 μl質粒，加入含有Hind Ш、Nco I的雙酶切體系，37 ℃ 培養箱酶切1 h。

2結果與分析

2.1PCR產物定量檢測

為了檢測預混系統對于PCR反應是否產生影響，使用PCR預混系統及正常系統克隆同一個目的基因（711 bp）（圖1），僅有目的基因出現在700 bp左右，2種系統的PCR產物均無非特異性條帶，使用Nanodrop2000 測定其濃度，3次試驗結果平均值分別為73與77 ng/μl，無明顯差異。因此，預混系統及正常系統在PCR的特異性及PCR的產量方面無明顯差異。

注：1.預混系統PCR；3.正常系統PCR；2，4.DNA laddrer。

圖1PCR結果

2.2PCR 產物連接效率檢測

為了驗證預混系統對于PCR產物的連接有無影響，使用2種系統的PCR產物進行連接，連接產物轉化后涂布于具有氨芐抗性的LB瓊脂平板，過夜培養后隨機挑選6個菌落進行質粒DNA的小量制備，然后用瓊脂糖凝膠電泳檢測其大小，結果見圖2，由圖2可知，3號質粒的移動較其余質粒慢，表示形成重組質粒的可能性較大，經過酶切鑒定確認為正確的重組子。此試驗重復5次，得出預混系統與正常系統的連接效率分別為23.3%、26.7%，兩者并無明顯差別，因此，認為預混系統與正常系統對PCR下游連接試驗無明顯差異。

注：3.正確連接的重組子；1、2、4、5、6.未連入的閉環載體。

圖2連接效率檢測

2.3酶切鑒定重組子

使用酶切法鑒定重組子，選擇預混系統與正常系統轉化的重組子，在設計引物時上下游引物中分別加入酶切位點Hind Ш與Nco I，因此使用Hind Ш、Nco I進行雙酶切可以將目的基因切下。由圖3可知，預混系統與正常系統轉化的重組子酶切結果有2條亮帶，分子量較大的是p-EGMT載體，分子量較小的是目的基因，因不明原因使得DNA ladder中條帶分辨不清，但仍可以判斷目的基因（711 bp）在500～1 000 bp，考慮到雙酶切且無非特異性條帶，因此可以斷定500～1 000 bp的條帶是目的基因。對于PCR下游的酶切反應，預混系統與正常系統無明顯差異。

3討論

PCR 技術是現代分子生物學和生物工程技術的里程碑，由于研究目的、技術要求不同，商品化的PCR試劑盒也根據實

際需要作適當的調整，形成了適合現代科學研究的技術平臺。

注：1.預混系統連接重組子的酶切產物；2.正常系統連接重組子的酶切產物；3.DNA ladder。

圖3酶切鑒定重組子

該研究針對預混“dye”及“density”的PCR系統進行了多項檢測，未發現和正常PCR系統的差異，且可以直接上樣檢測，在操作上簡化了步驟，特別適合試驗教學的開展。

另外，PCR系統經過不斷創新出現了大量的衍生品試劑盒，對于PCR操作的成功率以及便利性具有很大提高，如DNA Taq酶經凍融多次后仍具有很高的活性，可以將DNA Taq酶、Mg2+ 、dNTP等按照一定比例混合在緩沖液中，大大簡化了PCR操作步驟，提高Mg2+ 濃度可以拮抗染色劑、指示劑等對于PCR系統的抑制，出現了SYBR等染色劑預混的實時定量PCR試劑盒，對于核酸與蛋白質功能的研究提供了新的手段[4]；針對模板鏈的特點也出現了一些PCR試劑盒，如高GC含量PCR試劑盒、超長鏈PCR試劑盒、熱啟動PCR試劑盒等。隨著技術的發展及不斷創新，PCR 技術正向簡便、快捷、個性化、高質量、智能化的方向發展，同時PCR 技術的應用也將不斷深入到科學研究的更多方面。

參考文獻

[1]

鄭景生，呂蓓.PCR 技術及實用方法[J].分子植物育種，2006，1（3）： 381-394.

[2] 李玉梅，姚紀元，吳靜.PCR-SSCP 技術的研究及應用進展[J].生物技術通報，2007（6）：71-74.

[3] 劉歆，徐根明，郭江峰，等.基于SYBR Green I的雙鏈DNA定量方法[J].中國生物工程雜志，2008，28（1）： 55-60.

[4] TUMA R S，BEAUDET M P，JIN X K，et al.Characterization of SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain：A Dye Optimized for Use with 300-nm Ultraviolet Transillu minators[J].Analytical Biochemistry，1999，268：278-288.