基因敲除GCV2的釀酒酵母構(gòu)建

熊志欽　周世水

（華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510006）

摘要 [目的] 構(gòu)建低甲醇生成的釀酒酵母工程菌用于釀造低甲醇酒。[方法] 利用基因敲除技術(shù)，敲除酵母代謝甘氨酸生成甲醇途徑的甘氨酸裂解酶系的基因GCV2。[結(jié)果] 成功構(gòu)建出基因敲除GCV2的工程酵母L5，用L5釀造酒中的相對甲醇含量為131 mg/L，比初始菌株的192 mg/L降低31%。[結(jié)論] 利用基因敲除GCV2的工程酵母菌可有效減少酒中由甘氨酸代謝生成甲醇的量。

關(guān)鍵詞 基因敲除；甲醇；釀酒酵母

中圖分類號 S188+.4 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2015）15-063-03

Construction of Saccharomyces cerevisiae with Gene Knockout GCV2

XIONG Zhiqin， ZHOU Shishui*

（School of Bioscience and Bioengineering， South China University of Technology， Guangzhou， Guangdong 510006）

Abstract [Objective] In order to brew low methanol wine， the engineering strain of Saccharomyces cerevisiae was constructed to produce low methanol wine. [Method] The technology of gene knockout was used to knockout GCV2 of glycine cleavage enzyme system in Saccharomyces cerevisiae metabolic pathway of glycine to methanol. [Result] It was succeed to construct the engineering strain L5 of knockout GCV2. The methanol is 131 mg/L in wine brewed by L5. It decreased 31% compared with 192 mg/L methanol in wine brewed by original strain. [Conclusion] It is effective to decrease methanol in wine from glycine metabolized by the Saccharomyces cerevisiae of gene knockout GCV2.

Key words Gene knockout； Methanol； Saccharomyces cerevisiae

甲醇是酒中一種對人體有害的物質(zhì)，其對人體致死量為143 mg/kg，特別是在人體內(nèi)有蓄積作用，不易排出[1]。因此，降低酒中甲醇的含量對飲酒人群的健康意義重大。而酒中甲醇來源主要有2個途徑：一是由果膠、纖維素等釀酒原料分解產(chǎn)生的甲醇，二是酵母菌自身代謝甘氨酸生成的甲醇[2]，即甘氨酸經(jīng)甘氨酸裂解酶系催化反應(yīng)生成甲醇，該酶系復(fù)合體中的甘氨酸脫羧酶是由基因GCV2編碼生成的P蛋白亞基。基因敲除或基因沉默GCV2能有效地阻斷酵母代謝甘氨酸生成甲醇[3]。因此，筆者構(gòu)建基因敲除酵母GCV2的工程菌，并應(yīng)用于釀造低甲醇健康酒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質(zhì)粒。

釀酒酵母S1由華南理工大學(xué)發(fā)酵工程實驗室保存，質(zhì)粒pUG6（含抗G418的Kanr篩選標(biāo)記）購于杭州寶賽生物科技有限公司。

1.1.2 酶、試劑和儀器。

TaqHS酶購于TaKaRa公司，G418、醋酸鋰購于紐普諾博生物制品有限公司，小量酵母基因提取試劑盒、質(zhì)粒制備試劑盒購于艾比根生物技術(shù)有限公司。安捷倫7890A氣相色譜儀、DBFFAP 毛細(xì)管柱（30 m×0.53 m×1.00 μm）和安捷倫 7694E 頂空進(jìn)樣器。

1.1.3 引物。

根據(jù)SGD（Saccharomyces genome database）數(shù)據(jù)庫的GCV2基因（S000004801）和GenBank的pUG6序列（No.AF298793.1）設(shè)計引物，基因GCV2驗證引物 A1、A2，KanA、KanB，GCV2基因敲除引物R2、L2，由英濰捷基貿(mào)易有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 基因GCV2的驗證。

以0.4 μl提取S1的DNA為模板，A1、A2為引物的PCR反應(yīng)體系10 μl，反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃預(yù)變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)30次，最后72 ℃延伸10 min，用瓊脂糖電泳驗證。

1.2.2 S1對抗生素G418耐受試驗。

抗生素G418的濃度分別為0、10、20、30和40 μg/ml。將S1分別涂布上述不同抗生素濃度的YPD平板上，30 ℃培養(yǎng)。

1.2.3 GCV2基因敲除組件的構(gòu)建。

以pUG6為模板，R2、L2為引物（5′端有45 bp與GCV2同源[4]），PCR擴(kuò)增100 μl GCV2基因敲除組件。

1.2.4 醋酸鋰法[5]轉(zhuǎn)化與陽性菌落PCR驗證。

將GCV2基因敲除組件用醋酸鋰轉(zhuǎn)化到OD600 nm=1的S1細(xì)胞中，涂布在含G418 40 μg/ml的YPD平板上，30 ℃培養(yǎng)3 d。挑選陽性菌落用引物KanA、KanB進(jìn)行菌落PCR，驗證GCV2敲除組件是否整合到S1。

1.2.5 陽性菌株與S1的發(fā)酵試驗。

用12°P麥芽汁 100 ml，接種1×107 CFU/ml，30 ℃發(fā)酵5 d，蒸餾出40%體積的酒，并測定乙醇和甲醇含量。

1.2.6 甲醇的頂空氣相測定法。

1.2.6.1 色譜分離條件。N2流速1.0 ml/min，干燥空氣流速350 ml/min，H2流速30 ml/min，壓力10.56 psi，分流比50∶1，檢測器溫度250 ℃，汽化室溫度150 ℃，進(jìn)樣量1 μl。程序升溫：先35 ℃保溫4 min，再以20 ℃/min升溫到180 ℃，并保溫5 min。

1.2.6.2 頂空進(jìn)樣條件。頂空瓶溫度80 ℃、平衡5 min，定量環(huán)溫度85 ℃、氣體填充0.5 min、平衡0.1 min，氣體傳輸線溫度90 ℃，樣品瓶壓力平衡0.2 min，進(jìn)樣1 min，振蕩幅度為1。

1.2.6.3 樣品的制備。配置300 mg/L乙酸丁酯為內(nèi)標(biāo)的40%vol樣品，其甲醇濃度分別為0、20、40、60、80、100 mg/L。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘氨酸裂解酶系基因GCV2的驗證

按“1.2.1”方法用引物A1、A2進(jìn)行PCR驗證S1的GCV2基因，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖1。

由圖1可知，PCR產(chǎn)物長度在353 bp，與設(shè)計GCV2基因的DNA大小一致，表明菌種S1含有甘氨酸裂解酶系的GCV2基因。

2.2 S1對抗生素G418的耐受試驗

按“1.2.2”方法進(jìn)行S1對抗生素G418的耐受性試驗，G418濃度為0、10、20、

30、40 μg/ml的YPD平板培養(yǎng)S1的結(jié)果見圖2。

由圖2可知，當(dāng)G418濃度達(dá)到40 μg/ml時，無Kanr抗性基因的酵母不能生長。

2.3 GCV2基因敲除組件的轉(zhuǎn)化結(jié)果

按“1.2.4”的醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將GCV2基因敲除組件轉(zhuǎn)化S1，挑選在含40 μg/ml的G418平板上生長的陽性菌落，按“1.2.1”方法進(jìn)行菌落PCR驗證，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，陽性菌L5、L6中含有大小為667 bp的GCV2敲除組件，與設(shè)計PCR驗證的DNA大小一致，說明GCV2敲除組件已正確整合到目標(biāo)酵母菌中。

2.4 菌株L5的發(fā)酵結(jié)果

取工程酵母菌L5、L6和S1，分別接種1×107 CFU/ml到12°P麥芽汁中進(jìn)行發(fā)酵，蒸餾后測定酒中乙醇和甲醇含量。

按“1.2.6”的甲醇頂空氣相測定，結(jié)果見圖4，根據(jù)氣相測定結(jié)果繪制出甲醇測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性方程：y=0.000 3x-0.006 4，其中，x為甲醇濃度，y為甲醇測定峰面積RF。

圖4 甲醇測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線

將測定甲醇的RF值帶入方程y=0.000 3x-0.006 4，得到甲醇含量最低的菌株L5，其發(fā)酵酒（酒精度為10.2%vol）的相對甲醇含量為131 mg/L，S1發(fā)酵酒（酒精度為9.6%vol）的相對甲醇含量為192 mg/L，L5釀造酒測定的色譜圖見圖5。由圖5可知，L5釀造酒中的相對甲醇含量比初始菌株S1的降低了31%，降到131 mg/L，且發(fā)酵酒的乙醇含量也有一定程度的提高，達(dá)到10.2%vol。這表明用基因敲除GCV2的工程酵母菌能夠有效降低釀造酒中的甲醇含量。

圖5 L5釀造酒的氣相色譜圖

2.5 L5的傳代穩(wěn)定性

對菌株L5進(jìn)行連續(xù)5代以上的傳代，分別按接種量1×107 cfu/ml接種到12°P麥芽汁，30 ℃發(fā)酵5 d，蒸餾測定酒中乙醇和相對甲醇濃度，結(jié)果見表1。

3 結(jié)論與討論

該試驗成功敲除了釀酒酵母S1的基因GCV2，切斷了甘氨酸生成甲醇的代謝途徑，從而成功構(gòu)建了低生成甲醇的釀酒酵母工程菌L5，利用L5的釀造酒中相對甲醇含量降低到131 mg/L，比初始酵母釀造酒的192 mg/L大幅度降低了31%。同時，L5不僅具有多次傳代發(fā)酵性能的遺傳穩(wěn)定性，而且乙醇的發(fā)酵力還略有提高。

但由于甘氨酸裂解酶系包含了4個蛋白亞基，而該試驗僅針對其編碼P蛋白亞基的GCV2基因進(jìn)行敲除。如果將另外3個蛋白亞基的基因進(jìn)一步敲掉，可能會構(gòu)建出甲醇生成更低的釀酒酵母菌，這將顯著提高釀造酒的健康品質(zhì)。

參考文獻(xiàn)

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