高效液相色譜法分析青莢葉中豆甾醇的含量

梁春輝，張寒，李雪寧

(1.西安市兒童醫院，陜西 西安 710003;2.西安醫學院 藥學院，陜西 西安 710021;3.興平408 醫院，陜西 咸陽 713100)

青莢葉［Helwingia japonica(Thunb)］為山茱萸科(Cornaceae)青莢葉屬(Helwingia Willd)植物，又名葉上花、葉上果，全株入藥。其根味辛，微甘，性平，能驅風除濕，祛瘀活血。可治胃痛、痢疾、便血、子宮脫出等病癥。其葉入藥，可治小兒高燒，外用治燒燙傷、毒咬傷，也有清熱解毒、消腫止痛的功效。其干燥莖髓入藥，藥名小通草，具有清熱利尿、下乳等作用［1］。

青莢葉的化學成分有β-谷甾醇、棕櫚酸甘油酯、桂 皮 酸、6α-H-4-烯-3-酮-豆 甾 醇、6α-H-4-烯-3-酮-豆甾醇［2］等。藥理實驗表明，β-谷甾醇、豆甾醇具有明顯的降膽固醇、止咳、抗癌、抗炎等藥理作用［3］。分析方法有薄層掃描法、氣相色譜法、高效液相色譜-紫外檢測法、高效液相色譜-ELSD 法等［4-5］。

本文采用RP-HPLC 測定青莢葉中豆甾醇含量，豆甾醇與相鄰組分分離度良好，方法的重復性、穩定性、精密度、加樣回收率均符合有關規定，可用于該藥材的質量控制。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

豆甾醇對照品(上海金穗生物科技有限公司，批號:JS90510);甲醇，色譜純;水為娃哈哈純凈水;氯仿等均為分析純;青莢葉，兩批采自秦嶺太白山，兩批購自西安萬壽路藥材批發市場，經西安醫學院生藥教研室張寒老師鑒定為山茱萸科青莢葉。

Agilent1260 高效液相色譜儀，Thermo C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，紫外檢測器;KQ-300B超聲波清洗器;GR-202 分析天平。

1.2 溶液配制

1.2.1 豆甾醇對照品溶液的配制 精密稱定豆甾醇對照品13.5 mg，置25 mL 容量瓶中，用甲醇∶氯仿(1∶1)溶解并定容，制成0.54 mg/mL 的豆甾醇對照品溶液。

1.2.2 豆甾醇供試品溶液的配制 精密稱取青莢葉藥材3 份，置500 mL 圓底燒瓶中，加入100 mL 甲醇∶氯仿(1 ∶1)，浸泡1 h，65 ℃水浴回流提取1 h，倒出提取液，再加100 mL 甲醇∶氯仿(1 ∶1)，65 ℃水浴回流提取1 h。倒出提取液，合并兩次提取液，放冷，抽濾，旋轉蒸發儀蒸干。加甲醇∶氯仿(1 ∶1)溶解，移至25 mL 容量瓶中，用甲醇∶氯仿(1 ∶1)定容，得供試品溶液。

1.3 色譜條件

色譜柱為Thermo C18柱(250 mm ×4. 6 mm，5 μm)，流 動 相 為 甲 醇∶ 水(97 ∶ 3)，流 速1.0 mL /min，進樣量20 μL，檢測波長210 nm［6］，理論塔板數為2 000 以上，豆甾醇峰的分離度符合要求。

2 結果與討論

2.1 青莢葉中豆甾醇含量測定

分別取對照品溶液和供試品溶液5 mL，用0.45 μm有機微孔濾膜過濾至微量離心管中，精密吸取20 μL，注入高效液相色譜儀，進行測定。結果見圖1、圖2。由圖1、圖2 可知，供試品中豆甾醇與對照品色譜峰保留時間一致，達到基線分離。

圖1 豆甾醇對照品液相色譜圖Fig.1 Stigmasterol control liquid chromatogram

圖2 青莢葉供試品液相色譜圖Fig.2 Helwingia sample liquid chromatogram

2.2 線性關系考察

精 密 量 取 對 照 品 溶 液0. 1，0. 2，0. 4，0. 8，1.0 mL至5 mL 容量瓶中，用甲醇∶氯仿(1∶1)定容，搖勻。分別進樣20 μL 測定。以對照品進樣濃度為橫坐標(X)，峰面積積分值為縱坐標(Y)，分別繪制標準曲線，得豆甾醇回歸方程y =6 252.2x－1.176 7，R2=0.999 5(n =5)。結果表明，豆甾醇進樣量在0.216 ～2.16 μg 范圍內，線性關系良好。

2.3 重復性

精密量取豆甾醇對照品溶液6 份，各20 μL，分別進樣，測定峰面積，每份樣品重復3 次，結果豆甾醇含量平均峰面積為3 321.37，RSD=1.43%。

2.4 加樣回收率

精密稱取青莢葉樣品3 份，精密量取1 mL 對照品溶液，分別加入到3 份樣品中，進行提取制樣，進行測定，計算加樣回收率。結果平均加樣回收率為97.79%，RSD 為3.107%。

2.5 樣品含量測定

取供試品溶液，用0.45 μL 微孔濾膜過濾后進樣測定，結果見表1。

表1 樣品測定結果Table 1 Samples for the determination of results

2.6 穩定性

精密量取豆甾醇對照品溶液，分別在0，2，4，8，12，24 h 各進樣20 μL，分別測定它們的峰面積，測得豆甾醇含量的RSD =0.97%，表明供試品溶液在24 h 內穩定。

2.7 流動相選擇

本實驗曾采用甲醇-水比例90 ∶10，96 ∶4，97 ∶3為流動相，流速1. 0 mL/min，結果表明以甲醇-水(97 ∶3)為流動相時豆甾醇的峰形及出峰時間(24 min)最佳。此條件下，方法的可靠性、準確性和重復性好，適用于青莢葉藥材中豆甾醇的含量測定。

3 結論

采用反相高效液相色譜法(RP-HPLC)測定青莢葉中豆甾醇的含量，色譜柱為Thermo C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為甲醇∶水(97∶3)，流速1.0 mL /min，進樣量20 μL，檢測波長210 nm。結果表明，豆甾醇進樣量在0. 216 ～2.16 μg 范圍內，其峰面積與濃度呈良好的線性關系(R2=0.999 5)，回收率為97.79%。該法靈敏、簡單易行，專屬性、重復性、回收率均符合要求。可作為青莢葉中豆甾醇的含量測定方法。

［1］ 李雙妹.青莢葉多糖的提取及含量測定［J］.溫州職業技術學院學報，2010，10(2):49-52.

［2］ Xia Lizi，Zhou Min，Xiao Yanhua，et al.Chemical constituents from Helwingiajaponica［J］.Chinese Journal of Natural Medicines，2010，8(1):16-20.

［3］ 李英霞，谷顏杰，馬承嚴. HPLC 同時測定大豆甾醇提取物中β-谷甾醇和豆甾醇的含量［J］.中成藥，2008，30(5):751-752.

［4］ 王淑美，吳明俠，許閩，等.地黃中β-谷甾醇的含量測定［J］.黑龍江醫藥，2001，14(4):255-256.

［5］ 張海波，李欽. HPLC-ELSD 法測定不同時期玉米須中β-谷甾醇的含量［J］. 河南大學學報，2006，25(4):53-55.

［6］ 魏志奇，陳幸，李彬，等.高效液相色譜法測定川木通中豆甾醇的含量［J］. 時珍國醫國藥，2009，20(3):574-575.