富G 寡核苷酸-N-甲基卟啉二丙酸熒光法測定鈾

李名慧，王永生

(南華大學 公共衛生學院，湖南 衡陽 421001)

鈾是一種無處不在的放射性元素。在工業廢棄物中，鈾主要呈陽離子復合物如氟化鈾酰、碳酸鈾酰、磷酸鈾酰或硫酸鈾酰等形式存在;在水溶液中，六價鈾最為穩定［1］。隨著經濟社會發展，鈾在軍事和核能方面的應用日益增加，人們有更多的機會暴露于這種有害金屬。因此，建立一種經濟、快捷測鈾的新方法也就勢在必行。本文基于富G 寡核苷酸形成的G-四聚體能與NMM 作用導致熒光顯著增強［2-4］，而UO2+2與NMM 在酸性環境下作用導致熒光猝滅，并抑制NMM 與G-四聚體的作用，且熒光強度變化值與UO2+2濃度在一定范圍內線性相關的原理，建立了富G 寡核苷酸-N-甲基卟啉二丙酸熒光法測定鈾的新方法。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

醋酸雙氧鈾、NMM、HEPES、MES、Tris-HCl 等均為分析純;DNA 制品:5’-AGGAAGATGGGAGGGAGGGAGGGTACTAT-3’;實驗用水均為滅菌超純水(電阻為18.26 MΩ);NMM 按照文獻［4-5］配制。

UV-2550 紫外-可見分光光度計;F-4500 熒光分光光度計;AB204-S 電子分析天平;PB-21 型精密酸度計。

1.2 實驗方法

取35 μL 2.16 ×10－6mol/L NMM 溶液，不同體積1.0 ×10－5mol/L UO2+2 標準溶液，40 μL pH 5.5的HEPES 緩沖溶液，40 μL 1. 0 mol/L KCl 溶液，40 μL 1.0 mol/L NaCl 溶液，依次加入2 mL EP 管中，用蒸餾水定容至450 μL，搖勻，常溫下反應20 min，加入50 μL 1.0 ×10－6mol/L DNA，室溫反應20 min，在熒光分光光度計進行560 ～700 nm 波長范圍內掃描，設置λex= 399 nm，在λmax= 609 nm處記錄空白組F0和實驗組F，得ΔF=F0－F。

2 結果與討論

2.1 熒光光譜特征

熒光光譜分析見圖1。

圖1 NMM--G-四聚體體系熒光光譜圖Fig.1 Fluorescence spectra of the NMM--Gquadruplex system

NMM 本身具有微弱的熒光。NMM 能夠特異性地識別G-四聚體［5］，導致體系的熒光強度顯著增強(圖1，曲線1)。在酸性環境中，可與之發生反應猝滅熒光。應用不同濃度的在酸性環境下與一定量的NMM 作用后，再加入適量的G 四聚體，此時溶液中剩余的NMM 可與G 四聚體結合，使熒光增強。濃度越高，則剩余的NMM 量就越少，體系相應的熒光值也就越低，即濃度與體系的熒光值大小成反比(圖1，曲線2 ～10)。由此說明，在實驗條件下，NMM 可能與作用形成復合物。與游離的NMM 不同，可能形成的NMM-復合物不能通過π-π 堆積作用而結合到G-四聚體表面，導致體系的熒光猝滅，且與濃度線性相關。

2.2 實驗條件的優化

2.2.1 緩沖溶液和pH 的選擇 分別在pH 5.5 的MES、HEPES、Tris-HCl 3 種緩沖體系中進行實驗，見圖2。

圖2 pH 值對熒光值的影響Fig.2 Effect of pH value on the fluorescence cDNA =0.1 ×10 －6 mol/L;cNMM =0.15 ×10 －6 mol/L;cUO22+ =0.4 ×10 －6 mol/L

由圖2 可知，該反應體系在HEPES 緩沖溶液中變化最明顯。在HEPES 緩沖溶液中，在pH 5.5 處ΔF 值最大;當pH 接近中性時，反應趨于終止。故本實驗選擇pH 5.5 的HEPES 緩沖溶液控制體系的酸度。

2.2.2 KCl 和NaCl 濃度對反應體系的影響 研究了不同濃度KCl 和NaCl 對熒光值的影響，結果表明，當KCl 和NaCl 的濃度均為80 mmol/L 時，體系熒光值變化最明顯。所以本實驗采用80 mmol/L 作為KCl 和NaCl 的最優濃度。

2.2.3 反應溫度對體系的影響 將反應體系分別在10，20，30，40，50，60，70，80，90 ℃的溫度下進行反應。結果顯示，反應在30 ℃時效果最好。溫度過低，分子運動速度慢;溫度過高時，形成的G-四聚體不穩定，NMM 無法與G-四聚體結合，從而影響實驗結果。

2.3 干擾物質的影響

為了評價本實驗對待測物的選擇性，根據環境樣品中其它金屬離子可能共存的情況，進行了干擾實驗。在相對標準偏差不超過10%的情況下，5 倍的Cu2+;10 倍的Ca2+;25 倍的Mg2+、Ni2+、Co2+、Pb2+;100 倍的Fe3+、Mn2+、Cr3+;200 倍的Hg2+、Cd2+均不會干擾實驗測定。由此可看出，各金屬離子對本方法的干擾較小，用本方法測選擇性高。

2.4 標準曲線、檢出限及精密度

依照實驗方法，加入不同濃度的鈾標準溶液進行實驗，繪制標準曲線見圖3。

由圖3 可知，在1.29 ×10－7～7.0 ×10－6mol/L范圍內，濃度與ΔF 呈線性關系，其回歸方程為:ΔF=4.91 +3.91 c(×10－7mol/L)，r=0.999 4。

根據CL= 3sb/k(sb為11 次空白值標準偏差，k為直線回歸方程的斜率)公式計算檢測限為3.86 ×10－8mol/L。平行配制11 管濃度分別為2. 0 ×10－7mol/L，1.6 ×10－6mol/L，5.0 ×10－6mol/L 的鈾標準溶液進行精密度的測定，其相對標準偏差分別為2.7%，3.9%和2.3%。

2.5 樣品分析

表1 樣品中測定結果(n=6)Table 1 Determination results ofin the samples

表1 樣品中測定結果(n=6)Table 1 Determination results ofin the samples

樣品 測定方法 測定值/(mol·L －1) RSD/% 加標量/(mol·L －1) 測定總值/(mol·L －1) 回收率/% t 1 a 7.97 ×10 －7 0.70 5.0 ×10 －7 12.96 ×10 －7 99.8 1.06 b 7.93 ×10 －7 0.56 5.0 ×10 －7 12.75 ×10 －7 96.3 2 9.93 ×10 －7 2.15 5.0 ×10 －7 14.86 ×10 －7 98.5 2.07 b 10.16 ×10 －7 2.70 5.0 ×10 －7 15.01 ×10 －7 a 97.1

3 結論

［1］ Solgy M，Taghizadeh M，Ghoddocynejad D. Adsorption of uranium(VI)from sulphate solutions using Amberlite IRA-402 resin:Equilibrium，kinetics and thermodynamics study［J］.Annals of Nuclear Energy，2015，75:132-138.

［2］ Hu D，Pu F，Huang Z，et al. A quadruplex-based，labelfree，and real-time fluorescence assay for RNase H activity and inhibition［J］. Chemistry，2010，16(8):2605-2610.

［3］ Qin H，Ren J，Wang J，et al. G-quadruplex facilitated turn-off fluorescent chemosensor for selective detection of cupric ion［J］. Chem Commun(Camb)，2010，46(39):7385-7387.

［4］ Zhao C，Wu L，Ren J，et al.A label-free fluorescent turnon enzymatic amplification assay for DNA detection using ligand-responsive G-quadruplex formation［J］. Chem Commun (Camb)，2011，47(19):5461-5463.

［5］ Guo L，Nie D，Qiu C，et al. A G-quadruplex based labelfree fluorescent biosensor for lead ion［J］.Biosens Bioelectron，2012，35(1):123-127.