禽流感細胞滅活疫苗（H9亞型，F株）安全性研究

楊廷佳 劉金晨 石寶蘭 張 偉 王 浩 李婷婷 趙 娟 沈海峰 周 揚

(國藥集團揚州威克生物工程有限公司,江蘇揚州 225127)

禽流感細胞滅活疫苗（H9亞型，F株）安全性研究

楊廷佳 劉金晨 石寶蘭 張 偉 王 浩 李婷婷 趙 娟 沈海峰 周 揚

(國藥集團揚州威克生物工程有限公司,江蘇揚州 225127)

將實驗室試制的禽流感細胞滅活疫苗(H9亞型,F株) (批號:201201、201202)通過頸部皮下注射的方式單劑量、單劑量重復、超劑量接種10日齡SPF雞進行安全性試驗。免疫后連續監測15天,每周稱重,用t檢驗分析對照組和免疫組體重之間的差異顯著性。試驗結果表明,免疫接種組和空白對照組體重差異不顯著,所制備的禽流感細胞滅活疫苗(H9亞型,F株)不影響雞的生長性能,安全性良好。

禽流感;細胞滅活疫苗;安全性試驗

以H9亞型AIV為代表的LPAI所引起的發病癥狀主要以呼吸系統疾病表現為主，但可能被混合感染和繼發感染其他病原或環境條件等因素所惡化，給養禽業造成極大的經濟損失[1，2]。針對我國現流行情況，H9禽流感全病毒滅活疫苗被廣泛的用于家禽中，但滅活疫苗有容易引起過敏反應、注射部位易引發炎癥等諸多缺點[3，4]。因此，安全性是任何一種生物制品在使用前必須具備的前提條件，為確定實驗室試制的禽流感細胞滅活疫苗（H9亞型，F株）對雞的安全性，特開展本試驗，現將結果報告如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 SPF雞 SPF雞蛋購自北京梅里亞維通生物技術有限公司，自行孵化，在相對隔離的環境中飼養。

1.1.2 試驗疫苗 禽流感細胞滅活疫苗（H9亞型，F株），由國藥集團揚州威克生物工程有限公司試制，批號：201201、201202。

1.2 方法

1.2.1 物理性狀檢驗

劑型 在玻璃燒杯內盛入2/3自來水或蒸餾水（22～25℃），靜止。用1 ml吸管分別吸取疫苗0.4 ml，垂直緩慢滴于液面上，觀察疫苗在水中的變化情況。

粘度 在室溫條件下（22～25℃），用內徑2.7 mm，出口內徑1.2 mm的1 ml吸管，分別吸取各批疫苗樣品1 ml，吸管垂直，使疫苗自然流出，計算放出0.4 ml疫苗所需的時間。

穩定性 分別取各批疫苗樣品約10 ml，以3000 r/min離心15分鐘，觀察疫苗分層及水相析出情況。

1.2.2 無菌檢驗 按現行《中國獸藥典》附錄作無菌檢驗。

1.2.3 甲醛含量測定 按現行《中國獸藥典》附錄進行檢驗，測定甲醛含量。

1.2.4 單劑量一次接種安全性試驗

將10日齡的SPF雞隨機分為3組，每組10只，第1、2組以頸部皮下注射的方式接種疫苗0.2 ml，第3組不免疫作為陰性對照，頸部皮下注射生理鹽水0.2 ml。疫苗免疫后，每周測定雞的體重，用統計學方法分析數據，若P＞0.05則說明體重之間沒有顯著差異，若P≤0.05則說明兩組數據之間存在顯著差異。若接種疫苗組雞的體重明顯高于或低于對照組雞，則說明疫苗不安全；若接種疫苗組雞和對照組雞的體重差不顯著，則說明疫苗安全。連續觀察15天，記錄疫苗接種部位和全身的臨床反應，然后剖殺所有雞，重點檢查注射部位的病變。

1.2.5 單劑量重復接種安全性試驗

試驗方法同1.2.4，免疫接種2周后，再重復接種一次，每天觀察各組雞是否出現全身癥狀，同時每周測定雞的體重。連續觀察15天后剖殺所有雞，重點檢查注射部位的組織病變。

1.2.6 超劑量一次接種安全性試驗法

試驗分組同1.2.4，試驗組每只頸部皮下接種疫苗1 ml（5倍單劑量），每天觀察各組雞是否出現全身癥狀，同時每周測定雞的體重。連續觀察15天后剖殺所有雞，重點檢查注射部位的組織病變。

2 結果與討論

2.1 物理性狀檢驗 結果見表1。

外觀 為乳白色乳劑。

劑型 疫苗滴于冷水中，呈油滴狀不擴散，為油包水型（W/O型）。

穩定性 以3000 r/min離心15分鐘，疫苗無分層現象，水相析出＜0.5 ml；在37 ℃左右條件下放置21日，未破乳。

粘度 疫苗垂直自然流出0.4 ml所需時間均小于8s鐘，符合規定。

2.2 無菌檢驗

三批疫苗無菌檢驗均無菌生長，符合規定。

2.3 甲醛含量測定

按現行《中國獸藥典》附錄進行檢驗，符合規定。

表1 疫苗成品檢驗結果

2.4 單劑量一次、單劑量重復接種安全性試驗

免疫后實驗雞精神、飲食飲水狀況正常，羽毛有光澤，叫聲響亮，未發現因注射疫苗后引起的局部及全身不良反應，15天后逐只進行剖檢，注射局部組織未見有明顯的肉芽腫脹。單劑量重復接種疫苗后，試驗雞均沒有任何臨床癥狀和全身不良反應。剖解，僅個別SPF雞注射部位殘存少量疫苗，但并沒有對組織造成的明顯的損傷。疫苗免疫對試驗雞的體重增長影響試驗結果表明（表2），免疫組和對照組的體重基本一致，差異不顯著（P＞0.05），因此疫苗的接種并不影響試驗雞的體重增長，安全性良好，證明實驗室試制的疫苗是安全的，可用于雞的免疫。

2.5 超劑量一次接種安全性試驗

超劑量一次注射（5倍正常使用劑量）后，初期SPF雞都表現出輕微的臨床癥狀，與對照雞相比，飲食量基本正常、精神稍差，喜臥，之后恢復正常，都沒有出現死亡，2～3d癥狀逐漸消失，精神飲食恢復正常。15天后剖殺，在注射部位均殘存有一定量的疫苗，并沿頸部皮下有遷移現象，但注射部位沒有出現出血和水腫癥狀。疫苗免疫對雞的體重增長影響試驗結果見表3，免疫組和對照組的體重差異不顯著（P＞0.05），疫苗的接種并不影響實驗雞的體重的增長。

表2 單劑量一次、單劑量重復接種SPF雞平均體重統計

表3 超劑量一次接種SPF雞平均體重統計

3 結論

本試驗在進行安全檢驗時，分別進行了單劑量、單劑量重復、超劑量接種，免疫后，不管是接種的局部，還是免疫組雞的全身，均無臨床反應。超劑量接種造成試驗雞在注射初期表現出一定的臨床癥狀，其原因可能是由于雞只過小或注射劑量過大，刺激注射局部腫脹、疼痛，導致精神稍差，并非疫苗毒性所致的全身反應。接種后每周檢測試驗雞體重，接種組和對照組的體重均不存在顯著差異，試驗結果證明實驗室試制的禽流感細胞滅活疫苗（H9亞型，F株）是安全的，制苗工藝是合理的。

[1] Kishida N，Sakoda Y Eto M，Sunaga Y，Kida H．Co-infection of Staphylococcus aureus or Haemophilus paragallinarum exacerbates H9N2 influenza A virus infection in chickens[J]．Arch Virol，2004，149（11）：2095-2104．

[2] 萬曉朋，曾顯營，田國彬.H9N2亞型禽流感流行株滅活疫苗種毒的篩選[J].中國預防獸醫學報，2010，32（4）：276-280.

[3] 李新生，陳紅英，黃宗梅，等.雞新城疫-傳染性支氣管炎-禽流感（H9N2）三聯滅活疫苗的安全性研究[J].中國畜牧獸醫，2010，（7）：1671-7236.

[4] 劉淑紅，焦鐵軍，李河林，等.雞新城疫、禽流感（H9亞型）二聯滅活疫苗的安全性和免疫效力試驗[J].中國獸藥雜志，2013，47（2）：14-17.