鴨病毒性肝炎活疫苗（CH60株）規模化生產工藝改進試驗

李辰龍王洪斌孫 心于洪濤

(1.東北農業大學動物醫學院,黑龍江哈爾濱 150030; 2.哈藥集團生物疫苗有限公司,黑龍江哈爾濱 150040)

鴨病毒性肝炎活疫苗（CH60株）規模化生產工藝改進試驗

李辰龍1，2王洪斌1孫 心2于洪濤2

(1.東北農業大學動物醫學院,黑龍江哈爾濱 150030; 2.哈藥集團生物疫苗有限公司,黑龍江哈爾濱 150040)

在鴨病毒性肝炎活疫苗(CH60株)生產時,用10日齡和11日齡進行病毒增值,同時把病毒稀釋倍數由100倍改為5000倍,將雞胚死亡高峰期、最終死亡率、單胚平均收獲單產、病毒含量ELD50進行對比分析,結果表明將病毒進行100倍稀釋后,用11日齡雞胚增值鴨病毒性肝炎弱毒(CH60株)與10日齡雞胚相比死亡高峰期時間、最終死亡率、病毒含量ELD50、單胚平均收獲單產等基本相同;將病毒進行5000倍稀釋后,用11日齡雞胚增值鴨病毒性肝炎弱毒(CH60株)與10日齡雞胚相比死亡高峰期時間推遲12～24h,最終死亡率基本相同、單胚平均收獲單產可提高30%左右、病毒含量ELD50略有上升;采用5000倍稀釋病毒,接種11日齡雞胚的生產工藝可以提高收獲單產,降低生產成本,提高產品效價。

鴨病毒性肝炎雞胚化弱毒(CH60株);稀釋倍數;接種日齡

鴨肝炎病毒包含小RNA病毒科、星狀病毒科和嗜肝病毒科3個病毒科。嗜肝病毒科的鴨肝炎病毒引起鴨乙型肝炎，其對鴨沒有顯著的致病性；星狀病毒科的鴨肝炎病毒引起Ⅱ型鴨肝炎；小RNA病毒科的鴨肝炎病毒引起Ⅰ型和Ⅱ型鴨肝炎，Ⅱ型鴨肝炎病毒的致病力不如Ⅰ型鴨肝炎病毒，對雛鴨的治病率一般不超過30%。現在流行的鴨肝炎主要是指Ⅰ型鴨肝炎，主要發生于雛鴨，臨床表現為發病急、死亡快，是一種具有急性、高度接觸性和致死性的傳染性疾病，死亡率可高達100%，給養鴨業造成很大危害。

哈藥疫苗有限公司用鴨病毒性肝炎雞胚化弱毒（CH60株）生產的鴨肝炎活疫苗，對預防Ⅰ型鴨肝炎有較好的效果，但在實際生產中用10日齡雞胚生產時，存在雞胚死亡時間早，不易收獲，單產低的情況。為解決這一實際情況，我們從種毒稀釋倍數和接種的雞胚日齡上，做了很多相關試驗，取得了一定的效果。

1 材料

（1）毒種

鴨病毒性肝炎雞胚化弱毒種（CH60株）由哈藥疫苗有限公司質量管理部提供，符合毒種標準，-70℃冰柜保存。

（2）SPF種蛋由哈藥疫苗有限公司SPF雞場提供，符合SPF種蛋標準規定。

2 方法

2.1 分組

將孵化到10日齡和11日齡的SPF的雞胚，各取400枚，再將10日齡的SPF雞胚400枚，分為A組和B組，每組分別為200枚；將11日齡的SPF雞胚400枚，同樣分為A組和B組，每組分別為200枚；

2.2 接種

分別將毒種進行100倍和5000倍稀釋，然后將100倍稀釋的種毒分別接種10日齡和11日齡雞胚的A組。將5000倍稀釋的種毒分別接種10日齡和11日齡雞胚的B組。每胚均為0.2ml/胚。

2.3 病毒增殖

接種后用蠟封孔，濕度60%，溫度37℃靜置培養。24h照胚棄掉早死的雞胚，然后每隔6h照胚一次，將死亡的雞胚2～8℃保存，到96h將雞胚全部取出2～8℃保存，活胚棄掉不要，記錄雞胚各時間段死亡情況。將2～8℃保存的雞胚24h內及時收獲，然后一起稱重、研磨混勻，留樣測ELD50使用。計算雞胚死亡高峰期、計算最終死亡率、單胚平均收獲單產。

2.4 病毒含量測定

將各組測病毒含量ELD50的留樣分別用無菌生理鹽水進行10倍系列稀釋，取10-5、10-6、10-7、10-84個稀釋度，每個稀釋度各尿囊腔接種發育良好的10日齡SPF雞胚5枚，0.2ml/胚，然后放在濕度60%，溫度37℃，靜置培養，24h死胚棄掉，觀察96h，記錄死亡情況，計算ELD50結果。〔5〕

2.5 相同試驗重復3次，進行對比

3 結果與分析

3.1 雞胚接種后死亡高峰期和最終死亡率

鴨病毒性肝炎雞胚化弱毒（CH60株），100倍稀釋后接種10日齡和11日齡雞胚與5000倍稀釋后接種10日齡的雞胚比較，死亡高峰期時間、最終死亡率基本相同。但5000倍稀釋后接種的11日齡雞胚，死亡高峰期時間推遲12～24h、最終死亡率與其他3組基本相同。見表1、圖1

圖1 最終死亡率對比

病毒100倍稀釋與5000倍稀釋相比，單位體積內病毒數量多了50倍，但病毒對雞胚的致死能力較強，所以10日齡和11日齡雞胚最終死亡率基本相同，沒有明顯差異；

而5000倍稀釋后，單位體積內病毒數量變成了1/50，病毒需要繁殖到一定數量，才能致死雞胚。11日齡雞胚對病毒的抵抗力較10日齡雞胚強，所以11日齡雞胚死亡時間推遲12～24h。

100倍稀釋接種11日齡雞胚與5000倍稀釋接種10日齡雞胚相比，雖然稀釋倍數相差50倍，但10日齡雞胚抵抗力沒有11日齡雞胚強，所以死亡高峰時間和最終死亡率基本相同。

3.2 雞胚接種后病毒含量和單胚平均收獲單產

鴨病毒性肝炎雞胚化弱毒（CH60株），100倍稀釋后接種10日齡和11日齡雞胚與5000倍稀釋后接種10日齡雞胚比較，病毒含量ELD50基本相同。5000倍稀釋后接種11日齡雞胚，病毒含量ELD50略有提升。

100倍稀釋后接種10日齡和11日齡雞胚單胚平均收獲單產基本相同；5000倍稀釋后接種11日齡雞胚，單胚平均收獲單產提高近30%。見圖2、見圖3

表1 雞胚接種后觀察結果、死亡高峰期、最終死亡率對比

圖2 平均收獲單產對比

圖3 病毒含量測定結果對比

100倍稀釋后接種10日齡和11日齡雞胚與5000倍稀釋后接種10日齡的雞胚比較，死亡高峰期時間、最終死亡率基本相同。病毒繁殖的時間基本相同，所以病毒含量ELD50基本相同。而5000倍稀釋后，單位體積內病毒數量變成了1/50，病毒需要繁殖到一定數量，才能致死雞胚，病毒繁殖時間延長，但10日齡雞胚較弱死亡早，所以接種11日齡雞胚病毒含量略有提升。

100倍稀釋后接種10日齡和11日齡雞胚與5000倍稀釋后接種10日齡的雞胚比較，死亡高峰期時間、最終死亡率基本相同。所以平均收獲單產基本相同。

5000倍稀釋接種11日齡，因雞胚對病毒的抵抗力較10日齡雞胚較強，死亡時間推遲12～24h，所以雞胚發育較大，平均收獲單產提高30%。見圖3

100倍稀釋接種11日齡雞胚與5000倍稀釋接種10日齡雞胚相比，死亡高峰時間和最終死亡率基本相同。所以病毒含量和平均收獲單產沒有明顯差異。但平均收獲單產，較100稀釋倍接種10日齡雞胚略高。

4 討論

（1）病毒100倍稀釋后接種10日齡和11日齡雞胚，5000倍稀釋后接種10日齡和11日齡雞胚，4個組相比，因為病毒本身對雞胚的致死能力較強，所以最終死亡率基本相同，但11日齡雞胚對病毒的抵抗力稍強，所以死亡高峰時間推遲12～24h，雞胚發育時間相對長，病毒繁殖時間要相應長，所以收獲單產提高30%左右，病毒含量略有提升。

（2）實驗結果表明雞胚的死亡高峰期，與雞胚對病毒的抵抗力、接種的病毒數量有直接的關系。10日齡雞胚與11日齡雞胚相比抵抗力差，所以減少病毒接種數量，其死亡的高峰期也沒有推遲。

（3）10日齡雞胚無論是100倍接種，還是5000倍接種，死亡時間都很早，雞胚發育小，再加上病毒對雞胚的作用，胚體較嫩，收獲時容易斷，也影響單產。11日齡雞胚本身多發育24h，胚體較有韌性，5000倍接種后又增加了一定的發育時間，所以收獲起來更容易，所以平均收獲單產增加較高。

（4）據有關資料介紹鴨肝炎病毒也可以在鴨胚成纖維細胞、鴨胚肝細胞上生長繁殖，今后在規模化生產上可以尋找適合的細胞來培養鴨肝炎病毒來替代雞胚培養，即可以降低生產成本，又可以減少生物安全方面的風險。

[1] 王勇，李廣興，劉思國.鴨病毒性肝炎的研究進展[J].畜牧獸醫科技信息，2007，（3）：7-9.

[2] 殷震，劉景華.動物病毒學（第二版）[M].北京：科學出版社，1997：510-511.

[3] 王明俊.獸醫生物制品學[M].北京：中國農業出版社，1997：297-309.

李辰龍，男，獸醫師，長期從事獸用生物制品質量檢驗與生產工作。

王洪斌，男，教授，博士生導師，研究方向：獸醫科學專業研究。