ELlSA法檢測(cè)牛口蹄疫免疫非結(jié)構(gòu)蛋白抗體的試驗(yàn)研究

才讓吉

(青海省海南州同德縣尕巴松多鎮(zhèn)獸醫(yī)站,青海海南 813299)

ELlSA法檢測(cè)牛口蹄疫免疫非結(jié)構(gòu)蛋白抗體的試驗(yàn)研究

才讓吉

(青海省海南州同德縣尕巴松多鎮(zhèn)獸醫(yī)站,青海海南 813299)

本實(shí)驗(yàn)采用間接ELISA方法檢測(cè)牛口蹄疫病毒(FMDV)常規(guī)疫苗免疫牛的FMD抗體水平。實(shí)驗(yàn)采用引進(jìn)的10頭大通野血牦牛接種FND滅活疫苗15d 后抗體產(chǎn)生情況,確定了血清抗體產(chǎn)生效價(jià)的OD值,實(shí)際操作證明該方法簡(jiǎn)易、快速、靈敏度高。

FMD;非結(jié)構(gòu)蛋白;ELISA;抗體檢測(cè)

口蹄疫病毒（FMDV）的衣殼是20面的對(duì)稱體，由VP1、VP2、VP3和VP4四種結(jié)構(gòu)蛋白構(gòu)成，除結(jié)構(gòu)蛋白外，F(xiàn)MDV還有幾種非結(jié)構(gòu)蛋白，包括前導(dǎo)蛋白酶2A、2B、2C、3A、3B、3C蛋白酶和3D聚合酶 及它們的前體（兩種以上蛋白的復(fù)合體）。

采用疫苗的國(guó)家，大多數(shù)動(dòng)物血清（FMDV）結(jié)構(gòu)蛋白和病毒感染相關(guān)抗原（VIAA既3D）抗體為陽性，因此，一些基于結(jié)構(gòu)蛋白和病毒相關(guān)抗原的診斷方法，很難確定FMDV感染與否，目前的疫苗生產(chǎn)工藝在病毒純化過程中去除了大部分的非結(jié)構(gòu)蛋白，因此用滅活苗免疫動(dòng)物體內(nèi)的抗體產(chǎn)生，而沒有病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體產(chǎn)生，為此檢測(cè)FNDV非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體的ELISA方法不但可以檢測(cè)隱性感染動(dòng)物，而且以區(qū)分感染動(dòng)物和免疫動(dòng)物，并能及時(shí)了解免疫動(dòng)物的抗體水平，有效預(yù)防動(dòng)發(fā)生FDV具有非常重要的意義。

1 使用范圍

FMDV非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體檢測(cè)ELISAKiT，檢測(cè)FMDV非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體，不受血清型影響，適用于疫區(qū)凈化檢疫，群體無癥狀評(píng)價(jià)和口蹄疫疫病的診斷。

2 原理

接種滅活疫苗免疫牛的間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（I—ELISA）法用于測(cè)定抗體，用抗原將固相載體致敏，加入含有特異抗體的血清，經(jīng)孵育一段時(shí)間后，固相載體表面的抗原和抗體形成復(fù)合物，洗滌除去其它成分，再加上酶標(biāo)記的抗抗體，加入底物，在酶的催化作用下與底物發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生有色物質(zhì)既可進(jìn)行顯色觀察，現(xiàn)多用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)儀，既酶標(biāo)儀進(jìn)行結(jié)果分析。

3 材料與方法

3.1 材料

3.1.1 試劑

3ABC基因表達(dá)蛋白包被ELISA板、洗板封閉、陰陽性對(duì)照、如果血清中有3ABC抗體與ELISA板上3ABC蛋白結(jié)合，形成抗原—抗體復(fù)合物，再與酶標(biāo)二抗結(jié)合，加入底A、B、終止液。

3.1.2 疫苗

FMD采用牛口蹄疫滅活疫苗，由中國(guó)威特生物科技股份有限公司生產(chǎn)的，批號(hào)為D10112J。

3.1.3 試驗(yàn)免疫動(dòng)物

選用青海省大通縣引進(jìn)的10頭野血牦牛進(jìn)行FDV滅活疫苗肌肉注射，每頭注射3ml，在首次免疫15d后采取V采血，制備血清，進(jìn)行FDN抗體檢測(cè)。

3.2 操作程序

（1）（PBST）用無離子水或蒸餾水做1：25倍稀釋

（2）待檢血清樣品和陰陽性對(duì)照血清用稀釋液1：21倍稀釋，（120μl血清稀釋液加血清6μl）每孔加入100μl陰陽對(duì)照血清樣品平行加兩孔，用封口膜封口，37℃結(jié)合30min。

（3）取掉封口膜，每孔加滿洗滌液，洗滌5次，最后一次拍干。

（4）用血清稀釋液按1：100比例稀釋酶標(biāo)二抗，每孔加入100μl，用封口膜37℃ 結(jié)合30min。

（5）取掉封口膜，每孔加滿洗滌液洗滌5次，最后一次拍干。

（6）將底物溶液A按1：50比例稀釋于底物溶液B（1ml底物B中加入20μl底物 A）混勻，每孔加入100μl，用封口膜封口，37℃避光作用不超過10min。

（7）每孔加入100μl終止液，注意要按加酶標(biāo)二抗的順序加入終止液，應(yīng)用酶標(biāo)儀492nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光值（OD492值）。

4 結(jié)果判定

本試驗(yàn)檢測(cè)了10份接種滅活疫苗15d的牛血清，其NSP—ELISA平均OD492nm值為0.3805，標(biāo)準(zhǔn)差為0.0685，臨界值=0.3805+0.0685×3=0.5860。有8份血清OD492nm值 超出臨界值，表明該I—ELISA對(duì)滅活疫苗免疫牛的特異性為96%以上。

5 結(jié)論

從上述計(jì)算中可以看到，免疫后15天抗體效價(jià)超出臨界值的牛血清有8份，免疫效果理想，抗體效價(jià)弱的只有兩頭。滅活疫苗免疫牛血清非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體的檢測(cè)結(jié)果表明，本次試驗(yàn)建立的FMD—3ABC—I—ELISA不但能鑒別免疫動(dòng)物抗體消長(zhǎng)情況，而且對(duì)非結(jié)構(gòu)蛋白中的3A、3B、3C對(duì)自然感染抗體也具有重大的意義，雖然本次試驗(yàn)血清份量少，但與上述計(jì)算結(jié)果完全吻合。

吸光度報(bào)告

圖1 96孔酶標(biāo)板檢測(cè)10份牛免疫血清樣品布局圖

[1] 排合爾丁·穆太力甫，李建玲，馬正海. 烏魯木齊地區(qū)牛口蹄疫O型Asia-Ⅰ型雙價(jià)滅活疫苗免疫效果的檢測(cè)與分析[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，（27）：9400-9401.