無致病力青枯菌株對煙草青枯病的控制作用

陳國康，周幫菊，周丹妮，肖崇剛，馬冠華，董國菊

西南大學植物保護學院，重慶市北碚區天生路2號 400716

無致病力青枯菌株對煙草青枯病的控制作用

陳國康，周幫菊，周丹妮，肖崇剛*，馬冠華，董國菊

西南大學植物保護學院，重慶市北碚區天生路2號 400716

為進一步揭示無致病力菌株對煙草青枯病的控病機理，以無致病力青枯菌株為材料，針對煙草青枯病進行了溫室控病及田間小區試驗，并通過抗藥性標記測定其抗藥性突變菌株在煙株體內的定殖狀況，同時分析處理后煙株體內苯丙氨酸解氨酶（PAL）、過氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）的活性變化。結果顯示:無致病力菌株Tbw1-7-3在溫室盆栽條件下對青枯病的相對防效達89.4%，其田間防效在發病初期10～20 d與藥劑農用鏈霉素處理間無明顯差異，且其抗藥性突變株在煙株根表和體內可短暫定殖。同時菌株Tbw1-7-3能提高寄主中PAL、POD和PPO 3種酶活性及促進病程相關蛋白（PRP）的積累。無致病力菌株對煙草青枯病具有較好的控制作用，以菌株Tbw1-7-3的防效最優。田間試驗也顯示Tbw1-7-3菌株在發病初期具有良好的控病效果。無致病力青枯菌株的控病機理可能兼有占位效應及誘導抗病性。

煙草青枯病；無致病力菌株；生物防治；控病機理

近年來由青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum E F Smith）引起的青枯病在我國南北方煙區普遍發生，常造成全株性萎蔫死亡，對煙草安全生產構成較大威脅［1-2］。利用無致病力青枯菌株防治作物青枯病，是目前植物病害生物防治的研究重點之一，并已有成功應用的案例［3-5］。一般認為是無致病力菌株所產細菌素發揮了控病作用［4-5］，或誘導了寄主作物的抗病性［6］。另有學者提出產細菌素的無致病力青枯菌株對青枯病具有較好的短期防效，可能還存在誘導抗性以及不同致病力菌株間的微生態競爭［7］。但目前無致病力青枯菌株防治青枯病的研究還停留在實驗室階段，鮮有田間試驗應用效果的報道。同時，無致病力青枯菌株分離自植物體內，具有對環境安全的優勢，且進入寄主的方式與致病菌相同。因此，以無致病力青枯菌株為生物防治材料，分析其控病效果及可能的作用機制，旨在為煙草青枯病的有效防治提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株：實驗室前期研究獲得的無致病力青枯菌Tbw1-7-3、Aujd5-2y、Aujd11-1-4、Tm002-2r、Tbw1-7-1-3、Tbw1-7-1-1、Tbw1-7-2和Tbw1-7-1-2 8個菌株，青枯致病菌FL-9-1菌株；煙草品種MSK326；對照藥劑為農用鏈霉素（石家莊曙光制藥廠生產）、硫酸鏈霉素和利福平（市售）。

1.2 方法

1.2.1 煙草青枯病溫室控病試驗

Tbw1-7-3等8株無致病力待測菌及青枯病菌，均采用傷根接種法［8］。選擇5～7葉期的盆栽自育煙苗，傷根接種待測菌發酵液，濃度4.0×108cfu/mL，接種量10 mL/株，每菌接種10株，3次重復。并于第一次接種后7 d再次傷根接種青枯菌FL-9-1菌懸液，濃度3.0×108cfu/mL、接種量10 mL/株，置于30℃人工溫室中促其發病。同時設置無菌水空白對照（CK空白）、僅接種病原菌的發病對照（CK病）和接種病原菌后再施用藥劑的防病對照（CK藥，農用鏈霉素濃度100 μg/mL，按10 mL/株灌根）。調查并記錄青枯病發病的嚴重度［9］。

1.2.2 煙草青枯病田間小區控病試驗

煙苗移栽前7 d，將濃度為3.0×108cfu/mL青枯致病菌發酵液均勻噴霧到土壤中制備病圃，施用量為200 mL/m2，同時將盆栽控病效果優良的菌株Tbw1-7-3發酵液以10 mL/株對煙苗灌根，分別于移栽后7 d及CK病首次出現癥狀時，將菌株Tbw1-7-3發酵液（100 mL/株）灌根，濃度為8.0×108cfu/ mL。CK藥：同樣于煙苗移栽7 d后及CK病初見癥狀時，以150 μg/mL農用鏈霉素100 mL/株灌根施用。

1.2.3 抗藥性標記及在煙草體內的定殖

對控病效果優良的菌株Tbw1-7-3進行抗藥性標記［10-11］，將獲得的突變菌株命名為Tbw1-7-3k。用突變株灌根接種煙苗，方法同溫室控病試驗。于處理后0.5、3.0、7.0、14.0、21.0和28.0 d分別采用組織印跡法和稀釋平板法［12］檢測突變菌株在煙苗根、莖和葉中的定殖狀況。

1.2.4 無致病力青枯菌株誘導煙草的抗病性

接種處理：按溫室控病方法進行傷根接種，分別為灌根等量無菌水（CK空白）、無致病力菌株Au004-1（CK陽性）發酵液和菌株Tbw1-7-3發酵液。于處理后1、3、5、7、9和11 d分別采集自頂葉向下數第4片完全展開葉作為測定酶活性樣品。

酶活性測定：參照李合生［13］的方法提取苯丙氨酸解氨酶（PAL）并測定活性；參照陳志誼等［14］的方法提取過氧化物酶（POD）并測定活性；參照李靖等［15］的鄰苯二酚法提取多酚氧化酶（PPO）并測定活性；參照江山等［16］和Boller等［17］的細胞間隙可溶性蛋白提取法提取病程相關蛋白（PRP），再經電泳分析［18］測定處理后第3天的葉片樣品。

2 結果與分析

2.1 溫室控病試驗

將平板抑菌效果較好的8個菌株用于溫室控病試驗。結果（表1）顯示：對煙草青枯病防效在80%以上的菌株有5個，其余3個菌株的防效在60%～80%之間。菌株Tbw1-7-3、Aujd5-2y和Aujd11-1-4處理的相對防效顯著高于其他菌株（P＜0.05）。

表1 供試菌株的溫室控病試驗結果①Tab.1The results of antagonistic strains against tobacco bacterial wilt in greenhouse

2.2 田間小區控病試驗

煙苗移栽30 d后，發病對照煙株開始出現發病癥狀，此后田間調查縮短為每5天1次。試驗結果（表2）顯示：在CK病初見發病后10 d，菌株Tbw1-7-3處理和農用鏈霉素處理開始出現病株，均不同程度地延遲了青枯病的發生期；在CK病發病后第10～20天時兩者的田間相對防效接近，兩處理間無顯著差異，但均出現下降趨勢；在CK病發病后30 d，菌株Tbw1-7-3處理和農用鏈霉素處理對煙草青枯病的防效均降至較低水平，且菌株Tbw1-7-3下降趨勢更加明顯。

表2 田間小區控病試驗相對防效①Tab.2The relative control efficacy in field plot trials

2.3 抗藥性標記及在煙株體內的定殖

通過抗藥性標記得到抗Stre 250 μg/mL和Rif 200 μg/mL的雙抗突變菌株Tbw1-7-3k，檢測顯示該菌株保持了較高的平板抑菌活性。采用傷根接種Tbw1-7-3k突變菌株后0.5～28 d，采用組織印跡法測定時僅在煙株根表檢測到突變菌株，而稀釋平板法則在煙株根、莖、葉內均檢測到了突變菌株，這表明該菌可以在煙株體內定殖，甚至可能在一定范圍內轉移擴展。檢測結果（表3）顯示，接種處理后煙株體內的菌量呈先升高后降低的趨勢，表明突變菌株在煙株體內只能短暫定殖。

表3 傷根接種后Tbw1-7-3k在煙株體內的定殖動態Tab.3The Population fluctuation of Tbw1-7-3k in tobacco plants after root-cutting inoculation

2.4 青枯無致病力菌株誘導煙株抗病性

與寄主抗性有關的酶活性測定結果（表4）顯示：經供試菌株Tbw1-7-3處理后煙株體內的PAL和POD酶活性，均高于CK空白；而煙株體內PPO酶活性則是在處理后第9天迅速升至峰值，并持續處于高位。初步表明，菌株Tbw1-7-3能誘導煙株產生抗青枯病菌的物質，且與寄主體內的PAL、POD和PPO酶活性提高有關。

與寄主抗性有關的PRP測定結果（圖1）顯示：與CK空白相比，菌株Tbw1-7-3接種煙株后，電泳圖譜盡管沒有出現新的蛋白條帶，但蛋白條帶著色更深，著色程度在陽性菌株和CK空白之間。表明該菌株處理煙株后，可誘導寄主產生與抗病性有關的更多PRP。

表4 菌株Tbw1-7-3處理煙株葉片中PAL、POD和PPO酶活性的變化Tab.4The dynamics of activities of PAL,POD and PPO in tobacco leaves after Tbw1-7-3 treatment

圖1 菌株Tbw1-7-3處理3 d后煙葉內PRP的電泳圖Fig.1The electrophoresis of PRP in tobacco leaves three days after Tbw1-7-3 treatment

3 結論與討論

控病試驗顯示，無致病力菌株對煙草青枯病具有控制效果，為今后的生產應用提供了控病生物防治資源。其中以接種Tbw1-7-3菌株的防效最優，田間試驗也顯示了該菌株在發病初期發揮了較好的控病作用。無致病力青枯菌株的控病機制可能兼有占位作用和抗性誘導，而非前人提出的單一作用［6-7］。

與藥劑農用鏈霉素處理相比，Tbw1-7-3菌株在發病中后期的田間防效開始下降，在第30天下降最為明顯。這種前期優異、后期頹勢防效的特點是植物病害生物防治研究中易出現的問題。解決的可能途徑：一是在初次施用拮抗菌株Tbw1-7-3后，每2周補施1次拮抗菌發酵液，連續2～3次，以提高拮抗菌在寄主體內的數量水平；二是在初次施用該拮抗菌株后2周改施農用鏈霉素1～2次，有助于達到持續控病的效果。

有研究提出根系傷口能促進拮抗菌進入番茄植株體內［19］，因此本試驗中采用了傷根接種方法，并且得到了較理想的防效，再次印證了前人的結論。也表明傷口不僅是青枯致病菌［20］進入植物體的主要通道，也是無致病力青枯菌進入寄主的主要方式。無致病力菌株經人為造成的傷口進入寄主體內有利于發揮其占位作用，甚至影響寄主的生理生化過程，并在標記菌株的定殖測定中得到證實。同時，也為生產上施用無致病力菌株傷根接種提供了依據。

研究顯示供試突變菌株Tbw1-7-3k可在煙株根表和土壤中存活，并在煙草體內轉移和定殖。菌株Tbw1-7-3k在煙株內的數量呈現先上升后下降的特點，表明該菌在煙草體內僅能短期定殖，顯示了一定的占位效應，這也為解釋初始菌株Tbw1-7-3田間防效后期下滑的現象提供了依據。原因可能是土壤中其他微生物等環境因子抑制了該菌株的增殖［5］。其作用機制有待進一步的研究。

試驗顯示無致病力菌株Tbw1-7-3具有誘導煙株產生抗青枯病物質的作用，與前人的研究結論基本一致［21-22］。本試驗中測定了與寄主抗性相關的酶活性及PRP。但該菌株誘導煙株積累較多PRP，僅表現為促進PRP含量增加，并沒有產生新的PRP。可能是由于供試菌株非源自煙株本身，而是從番茄青枯病株上分離獲得，其作用機制僅是激活了煙株固有的與PRP抗性蛋白相關的代謝過程。

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責任編輯 董志堅

Control Effects of Avirulent Strain Tbw1-7-3 ofRalstonia Solanacearumon Tobacco Bacterial Wilt

CHEN Guokang,ZHOU Bangju,ZHOU Danni,XIAO Chonggang*,MA Guanhua,and DONG Guoju College of Plant Protection,Southwest University,Chongqing 400716,China

To further reveal the control mechanism of avirulent strains of Ralstonia solanacearum against tobacco bacterial wilt,biocontrol trials were conducted in a greenhouse and field plots.The colonization of drug-resistant mutant strains in tobacco plants was determined via drug resistance marker,and the changes of activities of enzymes PAL,POD,PPO in the treated tobacco plants were analyzed.The results showed that the relative control efficacy of avirulent strain Tbw1-7-3 against tobacco bacterial wilt was up to 89.4%in greenhouse.At the early stage（10-20 days）after disease occurrence,the control efficacy of Tbw1-7-3 was comparable to that of streptomycin in fields,its drug-resistant mutant strain Tbw1-7-3k could colonize on the surface of tobacco roots and in tobacco plants for a short duration.Meanwhile, Tbw1-7-3 promoted the activities of PAL,POD,PPO and the accumulation of pathogenesis-related protein（PRP）in hosts.Avirulent strains possessed better control efficacy against tobacco bacterial wilt, especially strain Tbw1-7-3.The field experiments also indicated that Tbw1-7-3 had good control efficacy at the early stage of disease occurrence.The antagonistic mechanism of avirulent strains against Ralstonia solanacearum might be the results of both position occupying and resistance inducing.

Tobacco bacterial wilt；Avirulent strain；Biological control；Antagonistic mechanism

S43

A

1002-0861（2015）11-0007-05

10.16135/j.issn1002-0861.20151102

2015-02-09

2015-06-12

重慶市煙草專賣局“重慶市煙草有害生物調查研究”（NY2010060103007）；西南大學學科團隊建設項目“作物病蟲害成災機理及持續控制的基礎研究”（2362015XK04）。

陳國康（1974—），博士，副教授，主要從事煙草病害生物防治、病害診斷與控制研究。E-mail：chenguokang@swu. edu.cn；*

肖崇剛，E-mail:chgxiao@swu.edu.cn

陳國康，周幫菊，周丹妮，等.無致病力青枯菌株對煙草青枯病的控制作用［J］.煙草科技，2015，48（11）：7-10，32. CHEN Guokang，ZHOU Bangju，ZHOU Danni，et al.Control effects of avirulent strain Tbw1-7-3 of Ralstonia solanacearum on tobacco bacterial wilt［J］.Tobacco Science&Technology，2015，48（11）：7-10，32.