高效液相色譜法測定癲癇患者血漿中奧卡西平活性代謝物的濃度及其血藥濃度與療效關(guān)系評價

張全英,徐文俊,俞蘊莉

(蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院 臨床藥理實驗室，江蘇 蘇州 215004)

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高效液相色譜法測定癲癇患者血漿中奧卡西平活性代謝物的濃度及其血藥濃度與療效關(guān)系評價

張全英,徐文俊,俞蘊莉

(蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院 臨床藥理實驗室，江蘇 蘇州 215004)

目的 建立測定血漿中奧卡西平活性代謝產(chǎn)物10-羥基卡馬西平(10-hydroxycarbazepine, MHD)的高效液相色譜方法并評價其血藥濃度與療效的關(guān)系。方法 以6-甲氧基水楊酸為內(nèi)標，用乙酸乙酯對血漿樣本進行提取。采用Symmetry Shield? RP18(4.6×250 mm, 5 μm)色譜柱，流動相為乙腈：0.05%甲酸水溶液(23:77,v/v)，流速為1.0 mL/min，檢測波長214 nm，柱溫40 ℃。收集服用奧卡西平片的門診和住院癲癇患者78例108個穩(wěn)態(tài)濃度血樣，以高效液相色譜法(high performance liquid chromatography-UV，HPLC-UV)測定MHD血藥濃度，參照療效評定標準評價血藥濃度與療效關(guān)系。結(jié)果 MHD濃度在0.4～40 μg/mL(r=0.998)線性關(guān)系良好，定量下限是0.4 μg/mL。日內(nèi)、日間RSD值均為<15.0%，MHD提取回收率在75.1%～78.5%，內(nèi)標提取回收率為86.5%。癲癇患者血藥濃度監(jiān)測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，服藥后2 h左右血漿藥物濃度達到峰值，不同患者之間的血藥濃度存在較大的差異。結(jié)論 該HPLC方法簡便、準確、靈敏度高，可應(yīng)用于臨床對服用奧卡西平患者進行MHD血藥濃度監(jiān)測。MHD的谷濃度控制在大于8 μg/mL的濃度范圍時對大多數(shù)癲癇患者能夠起效。

奧卡西平；高效液相色譜法；10-羥基卡馬西平；血藥濃度監(jiān)測

奧卡西平(oxcarbazepine，OXC)，是卡馬西平(carbamazepine，CBZ)的10位酮基衍生物。主要適用于成年人和5歲及以上兒童患者，對原發(fā)性全面性強直-陣攣發(fā)作和部分性發(fā)作，伴有或不伴有繼發(fā)性全面性發(fā)作癲癇患者有較好治療效果。OXC在體內(nèi)主要以其活性代謝產(chǎn)物10-羥基卡馬西平(10-monohydroxycarbamazepine, MHD)發(fā)揮藥理活性，主要作用機制是阻斷電壓敏感性鈉離子通道持續(xù)、高頻、反復(fù)點燃，以達到抑制神經(jīng)元的反復(fù)放電和減少突觸對興奮沖動傳遞而達到控制癲癇發(fā)作的目的[1]。年齡、性別、肝腎功能、血常規(guī)、合并用藥等因素均可能影響MHD藥動學(xué)參數(shù)而使其血藥濃度有差異。文獻報道，對于老年人患者和腎功能損傷患者，MHD的清除率降低[2-3]；對于兒童、懷孕或合并用其他酶誘導(dǎo)劑的患者，MHD的清除率增加[4-6]。當血清中MHD的濃度超過35 μg/mL時[7]，較易發(fā)生不良反應(yīng)，主要有疲勞、頭痛、頭暈、嗜睡和低鈉血癥等。OXC常需長期使用，聯(lián)合其他抗癲癇藥物治療也較常見，這導(dǎo)致MHD的血藥濃度不易控制，所以臨床上有必要對MHD血藥濃度進行監(jiān)測，以達到有效控制癲癇發(fā)作和減少不良反應(yīng)發(fā)作的目的。本文在建立測定人血漿中MHD高效液相色譜法的基礎(chǔ)上，對臨床單藥或多藥服用奧卡西平患者進行血藥濃度監(jiān)測，并初步評價MHD穩(wěn)態(tài)血藥濃度與療效的關(guān)系，為合理用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器 HPLC-UV系統(tǒng)：Agilent 1260 Infinity高效液相色譜儀(Agilent公司，美國)；Agilent 1260 VWD VL 紫外檢測器(Agilent公司，美國)；數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)為Chem Station for LC systems Rev B.04.02 SP1[256](Agilent公司，美國)

1.2 藥品與試劑 10-羥基卡馬西平對照品(Tocris Bioscience，批號：29331-92-8，含量：>99%)；6-甲氧基水楊酸(內(nèi)標)對照品(Sigma Aldrich，批號：MKAA3439，含量：98.0%)；甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純；乙酸乙酯為分析純；水為滅菌注射用水；空白血漿由蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院血庫提供。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件:選用Waters公司Symmetry Shield?RP18(4.6×250 mm，5 μm)色譜柱，Phenomenex Security GuardTMC18(4 mm×3.0 mm)預(yù)柱，流動相由乙腈：0.05%甲酸水溶液=(23:77，v/v)組成，柱溫為40 ℃，流速為1.0 mL/min，波長為214 nm，進樣體積為20 μL，每個樣本的分析時間為20.0 min。

1.3.2 溶液配制：精密稱取MHD對照品10.00 mg置于10 mL容量瓶中，加入適量乙腈溶解并定容到刻度，混勻得到濃度為1.0 mg/mL MHD儲備液，用乙腈依次稀釋至濃度為10、15、25、75、250、500、1000 μg/mL的標準曲線工作液；另外取MHD對照品10.00 mg置于10 mL容量瓶中，加入適量乙腈溶解并定容到刻度，混勻得到濃度為1.0 mg/mL MHD儲備液，用乙腈依次稀釋至濃度為20、200、750 μg/mL的質(zhì)控工作液。精密稱取6-甲氧基水楊酸對照品10.20 mg(含6-甲氧基水楊酸10.00 mg)置于10 mL容量瓶中，加入適量甲醇溶解并定容至刻度，混勻得到濃度為1.0 mg/mL的內(nèi)標儲備液，用乙腈將其稀釋為60 μg/mL的內(nèi)標工作液。儲備液與工作液均置-30 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 血漿樣本處理：精密吸取肝素抗凝血漿樣品500 μL，加入50 μL 10%的甲酸水溶液和 50 μL內(nèi)標工作液，混勻，渦旋混勻后加入3 mL乙酸乙酯提取，渦旋3 min后于4000 min、4 ℃條件下離心10 min。取盡上清液至試管中，真空濃縮儀濃縮揮干，以新配制的流動相(乙腈:0.05%甲酸水溶液=30:70)200 μL復(fù)溶，渦旋3 min后于16000 r/min、4 ℃條件下離心10 min，取上清液轉(zhuǎn)移至進樣瓶中。按“1.3.1色譜條件”項下測定，記錄峰面積和色譜圖。

1.3.4 專屬性考察：在本試驗條件下，MHD和內(nèi)標(6-甲氧基水楊酸)均有較高的靈敏度和較好的分離度，不同來源空白血漿內(nèi)源性物質(zhì)對MHD測定無干擾。癲癇患者合并服用的苯妥英鈉、卡馬西平和丙戊酸等抗癲癇藥物也不影響測定，MHD和內(nèi)標的保留時間分別為8.97 min和17.84 min左右(見圖1)，所以本方法可用于MHD的血漿濃度測定。

圖1 不同血漿的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of different plasma

1.3.5 標準曲線的制備及最低定量限：精密吸取空白血漿480 μL，分別加入MHD標準曲線工作液20 μL，配制成相當于MHD血漿濃度為0.4、0.6、1.0、3.0、10.0、20.0、40.0 μg/mL的S1～S7標準曲線血漿樣本。按“1.3.3 血漿樣本處理”項處理操作，進行HPLC-UV分析，記錄峰面積和色譜圖，以MHD峰面積As與內(nèi)標峰面積Ai比值f(f=As/Ai)對MHD濃度(C)進行權(quán)重回歸(權(quán)重系數(shù)為1/C2)。典型的MHD標準曲線回歸方程f=0.224C+0.005，r=0.998。MHD的線性范圍為0.4 ～ 40.0 μg/mL，定量下限為0.4 μg/mL。

1.3.6 精密度與準確度:精密吸取空白血漿480 μL，分別加入MHD質(zhì)控工作液20 μL，配制成含MHD低、中、高(0.8、8、30 μg/mL)濃度的血漿質(zhì)控樣本，每個濃度5份，每天1批，連續(xù)制備并測定3批，每批隨行一條標準曲線，計算出實測濃度。按“1.3.3 血漿樣本處理”項處理操作。用Excel軟件將同一濃度3批共15個樣本的實測濃度進行單因素方差分析，分別算得3個濃度日內(nèi)和日間精密度，見表1。

表1 血漿中MHD精密度與準確度測定結(jié)果

計算得到MHD低、中、高3個濃度血漿質(zhì)控樣本的平均回收率分別是75.9%、78.5%和75.1%，內(nèi)標的提取回收率為86.5%，且不同來源血漿的對照樣本和血漿提取樣本中MHD峰面積RSD≤15%，內(nèi)標峰面積RSD≤15%。

1.3.8 穩(wěn)定性：分別考察MHD低、中、高3個濃度水平的血漿樣品在不同保存條件下的穩(wěn)定性，結(jié)果顯示：MHD血漿樣本室溫放置6 h、-30 ℃反復(fù)凍融3次、-30 ℃低溫放置14 d、待測樣本于自動進樣器(4 ℃)中放置24 h情況下均穩(wěn)定，相對誤差(RE)均<15%。MHD和內(nèi)標6-甲氧基水楊酸儲備液在室溫放置6 h和在-30 ℃冷凍保存20 d情況下均穩(wěn)定。

1.3.9 血藥濃度監(jiān)測：收集神經(jīng)內(nèi)科78例癲癇患者(男性54例，女性24例)常規(guī)單藥或者多藥服用奧卡西平后108個血漿樣本，其中穩(wěn)態(tài)谷濃度血漿樣本43個。患者主要給藥方案為口服奧卡西平片300 mg,bid，部分患者合并使用丙戊酸、苯巴比妥、卡馬西平、左乙拉西坦、拉莫三嗪和托吡酯等抗癲癇藥物。

2 結(jié)果

2.1 血藥濃度監(jiān)測結(jié)果 圖2顯示的是血藥濃度與采血時間散點分布圖，數(shù)據(jù)包括穩(wěn)態(tài)谷濃度和穩(wěn)態(tài)服藥后濃度。按“1.3.3 血漿樣本處理”項對含藥血樣處理，測定MHD的血藥濃度。由圖可知，服藥后2h左右血漿藥物濃度達到峰值，不同患者之間的血藥濃度存在較大的差異。

圖2 采血時間與MHD血藥濃度觀測值散點圖Fig.2 Scatter plot of sample time vs serum concentration of MHD

2.2 奧卡西平單藥治療時MHD穩(wěn)態(tài)谷濃度與療效關(guān)系 參照療效評定標準[8]：2個月的用藥次數(shù)與用藥前相比，發(fā)作次數(shù)減少<50%無效，減少50%～74%為有效，減少75%～99%為顯效，臨床完全無發(fā)作為控制。對單藥服用OXC癲癇患者的32個MHD穩(wěn)態(tài)谷濃度數(shù)據(jù)進行評價，見表2。10例病情受到控制的患者MHD血藥濃度均高于8 μg/mL；7例無效患者血藥濃度均低于8 μg/mL，2例患者在較高血藥濃度(13.15，16.10 μg/mL)時仍然無效；4例患者在較低血藥濃度(≤3 μg/mL)時也表現(xiàn)為有效。

表2 單藥服用OXC臨床療效統(tǒng)計結(jié)果

3 討論

3.1 藥物濃度測定方法的選擇 本研究的血漿前處理方法采用的是有機溶劑萃取法，考慮到癲癇患者藥物治療時，可能需要同時合并其他抗癲癇藥物或一些其他藥物，選用有機溶劑萃取法可以更好地排除內(nèi)源性物質(zhì)和其他抗癲癇藥物對MHD的測定干擾。方法提取溶劑選用乙酸乙酯與文獻報道的乙醚和叔丁基甲醚相比更優(yōu)，在含藥血漿與乙酸乙酯體積比為1:6時，最低定量限可達0.4 μg/mL。文獻報道中，MHD的血藥濃度測定時選用的內(nèi)標有卡馬西平[9]、苯巴比妥[10]、溴西泮[11]等，但此類藥物為神經(jīng)科常用藥物，本實驗中若作為內(nèi)標可能對臨床測定有影響。本文選用的內(nèi)標為6-甲氧基水楊酸，弱酸性，內(nèi)標和MHD在此條件下峰型尖銳，分離度較好。該方法應(yīng)用對臨床癲癇患者進行血藥濃度測定時，常用的抗癲癇藥物丙戊酸、卡馬西平、苯妥英鈉對MHD的測定無干擾，說明方法具有較好的特異性。

3.2 單藥治療癲癇的療效評價 臨床對于MHD確切的有效血藥濃度范圍尚無定論，文獻報道的參考范圍有3～32 μg/mL[12]，12～30 μg/mL[13]，12～35 μg/mL[14]，3～40 μg/mL[15]，3～35 μg/mL[16]等。為避免聯(lián)合用其他抗癲癇藥物對治療癲癇療效評價的干擾，本文對單藥服用OXC癲癇患者的32個MHD穩(wěn)態(tài)谷濃度數(shù)據(jù)進行療效評價。由目前的數(shù)據(jù)來看，MHD的谷濃度控制在大于8 μg/mL的濃度范圍時對于大多數(shù)癲癇患者能夠起效，若小于8 μg/mL則無效的可能性更大。研究表明，MHD是糖蛋白(p-glycoprotein，P-GP)的作用底物[17]，癲癇患者血腦屏障處P-GP表達增多[18]，導(dǎo)致MHD到達作用靶點濃度減少。本研究發(fā)現(xiàn)的2例患者MHD在較高血藥濃度下癲癇控制仍無效可能與此有關(guān)。同時，實驗數(shù)據(jù)里個別癲癇患者在較低谷濃度情況下控制有效，提示MHD的有效濃度范圍較寬，與文獻報道一致，原因有待進一步研究。

本研究建立了測定奧卡西平活性代謝產(chǎn)物MHD的HPLC方法，方法特異性強，靈敏度高，可滿足臨床對服用奧卡西平患者MHD的血藥濃度監(jiān)測。本研究收集的谷濃度數(shù)據(jù)分析顯示，對于大多數(shù)癲癇患者，控制MHD谷濃度大于8.5 μg/mL時對癲癇發(fā)作控制較好。

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(編校：王冬梅)

Determination of plasma concentration of oxcarbazepine active metabolite in epilepsy patients by HPLC and evaluation of the relationship between concentration and efficacy

ZHANG Quan-ying,XU Wen-jun,YU Yun-li

(Department of Clinical Pharmacology, The Second Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215004, China)

ObjectiveTo develop an HPLC method for the determination of 10-hydroxycarbamazepine(MHD) of oxcarbazepine active metabolite in human plasma and evaluate the relationship between concentration and efficacy.MethodsUsing 6-methoxysalicylic acid as internal standard, MHD was extracted by ethyl acetate.A Symmetry ShiledTMRP18column (4.6 × 250 mm,5 μm) was used, with the mobile phase of acetonitrile and water containing 0.05% formic acid(v/v,23:77)at the detection wavelength of 214 nm.The flow rate was 1.0 mL/min and the column temperature was 40 ℃.Measured concentrations of MHD from 108 blood samples of 78 epileptic patients by HPLC-UV, and all corresponding clinical data were collected from the medical records of the population.The relationship between serum concentration and clinical efficacy was evaluated by assessing curative effect criterion.ResultsThe calibration curve was linear in the range of 0.4～40 μg/mL (r=0.998) and the detection limit was 0.4 μg/mL.The RSD of intra- and inter- day precision was both less than 15%.The range of extraction recovery ratio of MHD was 75.1%～78.5%.Extraction recovery ratio of internal standard was 86.5%.The results of therapeutic drug concentration monitoring (TDM) for MHD showed that after taking epilepsy about 2 h, plasma drug concentration reached its peak, there was a large difference between different patients blood drug concentration. ConclusionThe method is simple, accurate, sensitive.It is suitable for clinical to study MHD blood concentration monitioring of patients after taking OXC.It is more effective for most patients with epilepsy that the therapeutic drug concentration of MHD is higher than 8 μg/mL.

oxcarbazepine; HPLC; MHD; therapeutic drug monitoring

蘇州市科技計劃項目(SYSD2012129)

張全英，女，本科，主任藥師，研究方向：臨床藥學(xué)，E-mail：sdfeyyq@163.com。

R971.6

A

1005-1678(2015)01-0106-04