縮宮素注射劑高分子量物質及過敏反應研究

汪玉馨,金衛紅,宗衛峰,黃青,陸益紅,史清水

(江蘇省食品藥品監督檢驗研究院，江蘇 南京 210008)

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縮宮素注射劑高分子量物質及過敏反應研究

汪玉馨,金衛紅,宗衛峰,黃青,陸益紅,史清水

(江蘇省食品藥品監督檢驗研究院，江蘇 南京 210008)

目的 針對縮宮素注射劑在臨床上可引起過敏性休克，水潴留等過敏反應的發生，考察縮宮素注射劑中的高分子量物質與其過敏反應發生的相關性。方法 采用凝膠過濾色譜法對其原料及其制劑中的高分子量物質進行研究，截留高分子物質，并進行豚鼠全身主動過敏(active systemic anaphylaxis， ASA)試驗及皮膚被動過敏(passive cutaneous anaphylaxis， PCA)試驗。結果 提取制備的縮宮素原料及注射用縮宮素中均檢出分子量大于5000的高分子物質，注射用縮宮素及其截留高分子物質(MW>5000)的溶液ASA試驗為陰性，但PCA試驗出現陽性結果。178批合成縮宮素注射液均未檢出分子量大于1500的高分子物質，過敏試驗結果均呈陰性。結論 提取工藝生產的注射用縮宮素或有可能造成過敏反應的發生，與該品種中檢出的高分子物質存在有一定的關聯性，有必要在生產工藝中控制高分子量物質的產生。

縮宮素注射劑；凝膠過濾色譜法；全身主動過敏試驗；皮膚被動過敏試驗

縮宮素為含二硫鍵的9個氨基酸組成的肽。其6個氨基酸組成的環狀結構與3個氨基酸構成的側鏈結構，為其發揮特異性興奮子宮作用所必要。其結構與人體垂體后葉產生的天然催產素相同。目前臨床上常用的縮宮素是從豬的垂體后葉中提取或化學合成的。它具有選擇性興奮子宮平滑肌的作用，主要用于催產、引產和產后止血等[1]。除偶有惡心、嘔吐、心率增快或心律失常，臨床上還可能引起皮疹，藥熱，面部潮紅或蒼白，氣喘，心悸，胸悶，腹痛，過敏性休克，水潴留等過敏反應[2-5]。針對這些不良反應，雖ChP 2010年版已在標準中增訂了過敏反應試驗，但未對樣品中的高分子量物質進行必要的研究，故本研究利用凝膠過濾色譜法對縮宮素原料及其制劑中的高分子量物質進行研究，并進行豚鼠全身主動[6-7]及皮膚被動過敏試驗[7]，考察縮宮素中的高分子量物質是否與其過敏反應具有相關性。

1 材料與方法

1.1 材料 島津LC-20 A型高效液相色譜儀：SPD-20A檢測器，SIL-20A自動進樣器，二元泵；Agilent 1100型高效液相色譜儀：二極管陣列檢測器，ALS自動進樣器，二元泵；縮宮素原料5批，其中提取制備的縮宮素原料1批(批號：10007)；液相合成制備的縮宮素原料2批(批號：100912，100701)；固相合成制備的縮宮素原料2批(批號：OT-PP-20100707(95%)，100606)。縮宮素制劑共181批，全部來自全國評價性抽樣，共涉及8個生產單位，其中縮宮素注射液178批，均由液相合成原料而來；注射用縮宮素共3批樣品，由提取原料生產而成。健康合格白色豚鼠，雌雄各半，購自無錫巿惠山江南實驗動物場，許可證號：SCXK(蘇)2009-0005。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件與系統適用性試驗：參照《國家藥品標準(化學藥品地方標準上升國家標準)》第十六冊胸腺肽溶液高分子量物質檢查標準[8]，用凝膠色譜柱(TSK GEL 2000SWxl 7.8 mm×300 mm，5 μm)，以三氟醋酸-乙腈-水(0.05:10:90)為流動相；柱溫30 ℃；流速為0.7 mL/min；檢測波長為214 nm。理論板數按核糖核酸酶A計算應大于5000，分離度按相鄰峰高與峰谷之比計算大于3.0(見圖1)。

圖1 系統適用性試驗色譜圖Fig.1 The chromatogram of system suitability test

1.2.2 線性：分取核糖核酸酶A(分子量137000)、胰島素(分子量5808)、胸腺肽α1(分子量3108)、生長抑素(分子量1638)標準品用流動相制成每1 mL中各含1 mg的溶液，另取縮宮素(分子量1007)標準品用流動相制成每1 mL中含10 IU的溶液，各取前述4種溶液各50 μL，縮宮素溶液150 μL，5種溶液混合制成分子量標準溶液。取分子量標準溶液 10 μL注入液相色譜儀記錄色譜圖進行系統適用性考察。并以各峰的保留時間為橫坐標，分子量對數為縱坐標作標準曲線，進行線性回歸，相關系數為0.90(見表1，圖2)。

表1 分子量標準溶液的各項參數

圖2 分子量標準曲線Fig.2 Molecular weight standard curve

1.3 縮宮素樣品測定 取5批縮宮素原料用水稀釋配制成濃度約80 IU/mL的溶液。取上述溶液20 μL注入液相色譜儀記錄色譜圖進行考察。

取3批注射用縮宮素樣品用水稀釋配制成10 IU/mL的供試品溶液進行測定。取178批縮宮素注射液樣品直接測定。分取上述溶液50 μL注入液相色譜儀記錄色譜圖進行考察。

1.4 豚鼠全身主動過敏試驗 取本品用氯化鈉注射液稀釋制成0.2 U/mL的溶液。取豚鼠6只，2天1次，給予每只動物0.5 mL各組相應的供試藥液，連續3次，然后分別于末次給藥后的14 d和21 d，給予每只動物前肢靜脈注射各組1.0 mL相應的供試藥液激發注射。觀察各組動物在激發注射后30 min內是否出現過敏反應。

1.5 豚鼠被動皮膚過敏試驗 設陰性、陽性對照組、受試物組。陰性對照組用氯化鈉注射液，陽性對照組用新生牛血清10倍稀釋液，受試物組用氯化鈉注射液稀釋制成0.2 U/mL的溶液。致敏每組6只，激發每組4只，均為雌雄各半。按無菌操作方法，隔日腹腔注射0.5 mL致敏，共計注射5次，然后于最后1次致敏注射后第10天，股動脈采血，分離血清，將各組6只豚鼠的血清分別混合，-20 ℃保存，2周內備用。然后取豚鼠兩側背部預先剪毛，于剪毛處皮內注射抗血清各0.1 mL。經48 h后，各組靜脈注射與致敏劑量相同的激發抗原加等量的1%伊文思藍染料溶液，1 mL/只。30 min后麻醉處死各組動物，剪取背部皮膚，測量皮膚內層的斑點大小，直徑大于5 mm者判定為陽性。本研究對8個廠家各1批縮宮素注射液(合成工藝)、3批注射用縮宮素(提取工藝)及從其中提取截留的高分子物質(MW>5000)，用氯化鈉注射液稀釋制成每1 mL中含有0.2單位的溶液，致敏并攻擊豚鼠，考察豚鼠被動皮膚過敏反應。

2 結果

2.1 縮宮素樣品測定 通過對5批縮宮素原料(提取制備、固相合成制備和液相合成制備)和181批縮宮素注射劑劑(注射用縮宮素和縮宮素注射液)進行考察比較，發現提取制備的縮宮素原料(圖3，圖8)及其制劑(注射縮宮素，圖4)在保留時間9.1 min左右有1較大的高分子量雜質峰，由系統性適用性試驗推測該雜質保留時間在胰島素前，其分子量可能大于5000，故采用超濾管截留分子量大于5000的雜質(圖5)，進行主動及被動過敏試驗，考察過敏反應與該雜質是否具有相關性。

圖3 提取制備縮宮素原料的HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of oxytocin raw material from extract preparation

圖4 注射用縮宮素的HPLC色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of oxytocin for injection

圖5 截留注射用縮宮素中分子量大于5000的HPLC色譜圖Fig.5 HPLC chromatogram of oxytocin for injection after intercepting high molecular weight substances (MW>5000)

固相合成制備的原料(圖6)與液相合成制備的原料(圖7)比較，高分子量雜質更少，其中主要雜質為保留時間約11.1 min(雜質1)，其位于縮宮素峰前，推測分子量在1000～1500；保留時間約16.8 min(雜質2)，其位于縮宮素峰后，推測分子量小于1000。在對不同生產工藝所得原料進行研究(圖8)，通過歸一化法計算縮宮素及各雜質峰面積比例發現，固相合成工藝所生產的原料雜質較少，未檢出雜質2。而通過液相合成所得原料縮宮素溶液中均有較明顯的雜質2存在。

圖6 固相合成制備縮宮素原料的HPLC色譜圖Fig.6 HPLC chromatogram of oxytocin raw material from solid-phase synthesis

圖7 液相合成制備縮宮素原料的HPLC色譜圖Fig.7 HPLC chromatogram of oxytocin raw material from liquid-phase synthesis

圖8 不同生產工藝縮宮素原料中高分子物質比較Fig.8 Comparison of high molecular weight substances in oxytocin raw material by different manufacturing technique

由于本次抽樣的178批縮宮素注射液樣品均由液相合成原料制備生產，在對其高分子量物質檢查中發現，主要高分子量物質均為雜質1和雜質2(見圖9)，且8個生產單位的注射液中均未出現注射用縮宮素中存在的分子量大于5000的高分子量雜質，高分子量物質研究結果與液相合成原料的研究結果一致。通過歸一化法計算縮宮素及各高分子物質峰面積比例發現，各生產單位雜質1比例均相似，而對于雜質2有明顯區別，采用同一原料的廠家E及廠家F生產的注射液中比例較高(見圖10)。

圖9 縮宮素注射液的HPLC色譜圖Fig.9 HPLC chromatogram of oxytocin injection

圖10 不同生產單位縮宮素注射液中高分子物質比較Fig.10 Comparison of high molecular weight substances in oxytocin raw material from different manufactures

2.2 豚鼠全身主動過敏試驗結果 各組動物在激發注射后30 min內，181批樣品結果均未見明顯過敏反應。

2.3 豚鼠被動皮膚過敏試驗結果 結果縮宮素注射液均未發生豚鼠被動皮膚過敏反應。而提取工藝的注射用縮宮素有2批及從注射用縮宮素提取截留的高分子物質(MW>5000)，有1批發生明顯的被動皮膚過敏反應(見圖11)。

圖11 被動皮膚過敏試驗結果A.陽性照；B.提取工藝的注射用縮宮素;C.注射用縮宮素提取截留的高分子物質(MW>5000)Fig.11 Results of PCA testA.positive sample B.oxytocin for imjection of extraction processC.high molecular weight substances(MW>5000)obtained from oxytocin injection

3 討論

注射用縮宮素由于原料取自提取的豬腦垂體，雜蛋白和核酸均未加控制，因此存在分子量大于5000的高分子物質，將分子量大于5000的雜質截留，截留前后的樣品均產生明顯的皮膚被動過敏反應，提示注射用縮宮素可能存在產生臨床不良反應(過敏反應)的風險，因此在現行的注射用縮宮素質量標準基礎上，應對其高分子量物質(MW>5000)進行進一步的控制。根據國家局對《多組分生化藥注射劑技術審評基本要求》要求，直接從動物原材料進行分離提取的制劑，還應嚴格按照要求，從源頭開始進行全程的嚴格控制，以保證最終產品的質量。研究發現對于提取工藝的縮宮素可以通過超濾截留的方法去除高分子物質，因此研究認為有必要在生產工藝中控制或去除產生的高分子量物質，從而降低臨床可能出現的過敏反應的風險。

從對制劑生產原料的質量研究情況看縮宮素注射液的原料均為液相合成工藝，九肽經還原后不再進行純化，因此其高分子量含量較高。而目前采用固相合成工藝可以提高縮宮素的純度達99%。一些企業已經把使用固相合成的縮宮素做成制劑，生產更高質量的縮宮素及其制劑。

過敏試驗結果比較可以發現，對于注射用縮宮素的致敏性，豚鼠全身主動過敏試驗檢測并不敏感，對潛在的致敏原不能有效預測和監控，與之相比，被動皮膚過敏試驗(PCA試驗)結果更為靈敏，對潛在的致敏原有更好的預測效果。針對目前很多制劑安全性評價時只進行ASA試驗，而未進行PCA試驗，提示應同時進行這2種致敏試驗的研究，才能更全面的評價藥物的致敏性，從而為臨床應用提供更安全可靠的保障。

[1] 吳國忠.常用中西藥物臨床特點及用藥護理[M].上海：上海世界圖書出版公司，2004：301-302.

[2] 統一藥品說明書及批準文號專項工作小組.國家藥品標準化學藥說明書內容匯編4[Z].2002：229-230.

[3] 統一藥品說明書及批準文號專項工作小組.國家藥品標準化學藥說明書內容匯編7[Z].2002：755-756.

[4] 王亞平，史亦麗.縮宮素致過敏反應2例[J].藥物不良反應雜志，2001(1)：48-49.

[5] 黃楚珠，陳瑞擎，佘白蓉.縮宮素致過敏反應文獻報道分析中國醫院用藥評價與分析[J].中國醫院用藥評價與分析，2010，10(8)：741-742.

[6] 中國醫藥科技出版社.中華人民共和國藥典2010版二部[M].2010：1106-1107.

[7] 國家食品藥品監督管理局.化學藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術指導原則[Z].2005：18-21.

[8] 國家藥典委員會.國家藥品標準(化學藥品地方標準上升國家標準)第十六冊[S].2003：118.

(編校：譚玲，王儼儼)

Studies on high molecular weight substances and allergic response of oxytocin injection

WANG Yu-xin,JIN Wei-hong,ZONG Wei-feng, HUANG Qing,LU Yi-hong,SHI Qing-shui

(Jianysu Province Food and Drug Supervision and Inspection Institute, Nanjing 210008, China)

ObjectiveTo investigate the high molecular weight substances in oxytocin injection and their relationships with the occurrence of allergic response including anaphylacticshock,water retention induced by oxytocin injection.MethodsGel-filtration chromatography was used to investigate high molecular weight substances in raw material and injections.Active systemic anaphylaxis (ASA ) test and passive cutaneous anaphylaxis (PCA) test were conducted on guinea pigs before and after the interception of high molecular weight substances.ResultsHigh molecular weight substances (MW>5000) were detected in raw material and injections from the extract preparation, which showed positive results in PCA tests before and after the interception, while ASA tests were all negative.However, no high molecular weight substances (MW>1500) were found in 178 batch injections from synthesis.ASA test and their PCA test were both negative. ConclusionAllergic response may occur while using injections from the extract preparation, which has a certain correlation with the high molecular weight substances (MW>5000).Therefore, the control of high molecular weight substances (MW>5000) in preparation is necessary.

oxytocin injection; gel-filtration chromatography; active systemic anaphylaxis test; passive cutaneous anaphylaxis test

汪玉馨，女，碩士，主管藥師，研究方向：藥檢藥理毒理，E-mail：wyx_carrie@163.com。

R967

A

1005-1678(2015)01-0085-04