殼聚糖介導HMGB1的siRNA對膿毒癥大鼠肝肺中細胞因子的影響研究

周凱,胡迎春

(瀘州醫學院附屬醫院 急診科，四川 瀘州 646000)

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殼聚糖介導HMGB1的siRNA對膿毒癥大鼠肝肺中細胞因子的影響研究

周凱1,胡迎春2

(瀘州醫學院附屬醫院 急診科，四川 瀘州 646000)

目的 以殼聚糖納米粒介導HMGB1的siRNA基因表達載體治療膿毒癥大鼠，為基因藥物研發及其臨床應用奠定實驗基礎和提供理論依據。方法 60只雄性SD大鼠，分成正常組、陰性組、模型低濃度組、模型中濃度組、模型高濃度組5組，每組12只。正常組行假手術，其余各組大鼠均行盲腸結扎穿孔術(CLP)構建膿毒癥模型；正常組在大鼠尾靜脈注射生理鹽水、陰性組注射單純納米粒，各濃度模型組注射不同濃度的殼聚糖- pGenesil-HMGB1混合微粒。ELISA檢測各組大鼠肝、肺組織炎癥因子IL-6、IL-10、TNF-α的表達，觀察比較各組大鼠存活率。結果 與正常組相比，陰性組肝肺組織中IL-6、TNF-α表達顯著升高(P<0.05)，而IL-10表達差異無統計學意義；各治療組IL-6、TNF-α表達顯著降低(P<0.05)，而IL-10表達升高(P<0.05)；高濃度組大鼠生存率優于中濃度組和低濃度組(P<0.05)。結論 殼聚糖納米粒聯合基因治療技術能夠顯著降低膿毒癥大鼠肝肺組織中TNF-α、IL-6的表達，上調其抗炎細胞因子IL-10的表達，顯著提高了膿毒癥大鼠的存活率。該技術有望形成制備新的基因藥物的治療體系，提高膿毒癥患者的生存率。

膿毒癥；基因治療；納米技術；細胞因子

膿毒癥是嚴重創傷、燒傷、休克、感染、外科大手術后常見的并發癥，是由于感染而導致的全身性炎癥反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)的臨床表現。屬于臨床常見急危重癥，如不能及時有效處理可合并多器官功能障礙綜合癥(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)。本病死率約30%，而重癥膿毒血癥和感染性休克患者病死率更高，其報道約20%～52%[1]。但現有的臨床治療方法有限，迫切需要新的治療藥物、方式、以及新的治療體系。因此，找到新的藥物以及構建安全、高效和靶向性治療體系成為醫學發展的方向。

隨著現代科學的發展，納米技術聯合基因治療技術讓廣大醫學工作者看到了治療膿毒癥的新希望，或可提高患者的生存率以及對預后帶來巨大收益[2]。本研究采用殼聚糖納米粒聯合基因治療技術治療膿毒癥，旨在通過測定膿毒癥大鼠肝、肺組織的炎癥因子表達情況，觀察大鼠存活率情況，為防治膿毒癥提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：雄性SD大鼠60只，平均體質量(300±15)g，健康狀況良好，常規飼養。由瀘州醫學院實驗動物中心提供，動物合格證號：2401217。本實驗遵循《實驗動物保護條例》。

1.1.2 主要試劑：殼聚糖(C12H24N2O9，Sigma-Aldrich公司)、質粒pGenesil(武漢晶賽公司)、鹽酸氯胺酮(上海第一生化藥業有限公司)、離心機(Eppendorf德國)、ELISA試劑盒(美國 ADL公司)。

1.2 方法

1.2.1 制備殼聚糖-質粒：pGenesil-HMGB1武漢晶賽公司合成HMGB1重組干擾載體pGenesil-HMGB1。取500mg殼聚糖溶解于1%乙酸溶液，超聲震蕩至澄清，121 ℃高壓滅菌20 min備用。pGenesil-HMGB1溶解于滅菌 20%Na2SO4溶液中。0.5%的殼聚糖與等體積的pGenesil-HMGB1溶液混合，在漩渦混合器上充分混勻后，12000 r/min、4 ℃離心20 min，沉淀物以PBS重懸，此為殼聚糖- pGenesil-HMGB1微粒混懸液。

1.2.2 動物模型制備與分組：雄性SD大鼠60只，隨機分為正常組、陰性組、模型低濃度組、模型中濃度組、模型高濃度組，每組各12只。實驗前適應性飼養1周后，禁食過夜，自由飲水。正常組行假手術，其余各組均行盲腸結扎穿孔術(CLP)致膿毒癥。以40 mg/kg鹽酸氯氨酮腹腔注射麻醉后固定，沿腹正中線作1.5 cm切口，結扎盲腸根部(避免結扎回腸及盲腸系膜血管)，用18號針穿刺盲腸4次，之后將盲腸還納腹腔，逐層縫合腹壁切口。各濃度模型組用24 G的靜脈套管針尾靜脈分別注射5、10、15 mg/kg殼聚糖- pGenesil-HMGB1混合微粒，在10 s內完成注射，即模型低濃度組、模型中濃度組和模型高濃度組。陰性組造模后注射單純納米粒。正常組行假手術，即開腹后擠壓盲腸數次后關腹，該組給予注射生理鹽水。

1.2.3 觀測指標：在大容量殼聚糖- pGenesil-HMGB1納米粒溶液尾靜脈注射后，分別于1、4、8提取大鼠肝、肺組織各50～100 mg。酶聯免疫吸附法(ELISA法)分析炎癥介質IL-6、IL-10、TNF-α的表達情況，操作方法按照試劑盒說明進行。同時，觀察膿毒癥大鼠在尾靜脈注射殼聚糖-pGenesil-HMGB1納米粒后0、12、24、36、48、72 h存活率。

2 結果

2.1 TNF-α在膿毒癥大鼠肝、肺組織中的表達比較 與正常組相比，陰性組肝、肺組織中TNF-α表達顯著升高趨勢(P<0.05)，隨時間變化無顯著趨勢；CLP后模型高、中、低濃度組肝肺中TNF-α表達均增加。與陰性組相比，而模型低、中、高濃度組、表達顯著降低(P<0.05)。各模型濃度組4d及8d后TNF-α表達逐漸降低。見表1。

表1 TNF-α在各組大鼠肝肺中表達比較

#P<0.05，與正常組相比，compared with normal group；△P<0.05，與陰性組相比，compared with negative group

各組大鼠肝臟中IL-6表達與TNF-α表達相似，但各模型濃度組大鼠4 d后仍有IL-6表達的升高，8 d時降低。各組大鼠在1 d和8 d肺臟中IL-6表達差異無統計學意義，在4 d時陰性組、模型低濃度組、模型中濃度組表達升高，與正常組、模型高濃度組差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 IL-6在各組大鼠肝肺中表達

#P<0.05，與正常組相比，compared with normal group；△P<0.05，與陰性組相比，compared with negative group；*P<0.05，與高濃度組比較，compared with high concentration group

正常組與陰性組大鼠IL-10濃度相比差異無統計學意義；與正常組相比，模型高、中、低濃度組大鼠IL-10在肝肺中表達升高(P<0.05)，差異有統計學意義。模型高濃度組肝肺組織中IL-10表達顯著高于中濃度和低濃度組(P<0.05)。見表3。

表3 IL-10在各組大鼠肝肺中表達

#P<0.05，與正常組相比，compared with normal group；△P<0.05與陰性組相比，compared with negative group；*P<0.05，與高濃度組比較，compared with high concentration group

2.2 各組存活率比較 術后72 h內，正常組大鼠沒有死亡，陰性組在36 h內死亡數為6，隨后至72 h沒有死亡。CLP各組死亡高峰為0～12 h內。注射高濃度殼聚糖- pGenesil-HMGB1納米粒膿毒癥大鼠72 h存活率較低濃度顯著升高(P<0.05)，高濃度組較中濃度組、中濃度組較低濃度存活率顯示不同程度的提高，但差異無統計學意義。見表4。

表4 各組大鼠不同時間段存活率比較[n(%)]

#P<0.05，與正常組相比，compared with normal group；△P<0.05，與陰性組相比，compared with negative group

3 討論

膿毒癥累及器官所致的損傷有不同程度傾向性，如最早最容易累及的器官是肺[3]，而最早出現能量代謝障礙的器官是肝[4]，并且肝肺中有大量的炎癥細胞，這些細胞因子的過度激活與膿毒癥的發展和預后有密切的關系，有利于從細胞因子角度探索膿毒癥的臨床治療方法。急慢性疾病等許多原因都可導致機體細胞因子的產生，這對于機體正常防御具有重要的意義[5]。但當過于強烈的刺激導致細胞因子產生過多時，則可能引起廣泛的損傷[6]。

一般情況下細胞因子可分為促炎細胞因子和抗炎細胞因子。TNF-α、IL-1β、IL-6等為促炎細胞因子，IL-4、IL-10、轉化生長因子(TGF-β)等為抗炎細胞因子。促炎細胞因子能夠促進一氧化氮、花生四烯酸、組胺等的產生，還能激活補體系統等，并可以相互作用，形成級聯反應的“細胞因子網絡”[7]，導致炎癥反應的加重。抗炎細胞因子能夠抑制促炎細胞因子的產生，影響單核細胞抗原提呈的能力，抑制T細胞和B細胞的活性等[8-9]，這對于維持機體內細胞因子網絡的平衡具有重要的作用。

細胞因子主要來源于巨噬細胞，而肝臟和肺臟中存在大量的巨噬細胞，血清中的細胞因子水平難以準確反映肝肺局部的細胞因子水平[10]。所以，只有檢測組織局部細胞因子水平才能準確的反映局部炎癥反應的嚴重程度。本研究中采用盲腸結扎穿孔術(CLP)致膿毒癥，結果發現陰性組大鼠肝肺組織中TNF-α、IL-6表達顯著升高，而IL-10較正常組沒有顯著變化，提示陰性組抗炎細胞因子并未發揮相應作用。

基因轉移是基因治療的關鍵技術，也是制約其成功開展的瓶頸問題。傳統的基因轉移系統分為2大類：病毒載體系統和非病毒載體系統。病毒載體系統是至今為止最有效的基因轉移方法。其基因轉移效率通常在90%以上，目前75%以上的基因治療臨床試驗中仍采用病毒載體[11]。然而，由于病毒載體自身的局限性，如載體的免疫原性和有限的基因載量，尤其是存在安全性問題，使其進一步的應用受到一定的限制和更為嚴格的控制。非病毒載體系統雖然無安全隱患，但其轉染效率不如病毒載體系統。因此，突破基因轉移瓶頸已成為基因治療領域的當務之急[12]。隨著納米技術的發展，人們開始研究納米基因載體，其系統內和細胞內基因轉移機理得到深入闡明[13]。設計與研制體內循環時間長，具有靶向特異的納米基因載體為突破基因治療的瓶頸，實現安全、高效和靶向性基因治療帶來了新的希望。

以納米顆粒作為基因轉移載體就是將DNA、RNA、PNA(肽核苷酸)、dsRNA(雙鏈RNA)等治療基因包裹在納米顆粒中或吸附在其表面，在細胞攝粒作用下，納米顆粒進入細胞內，釋放治療基因，進而發揮其基因治療效能[14-15]。本研究采用殼聚糖納米粒介導HMGB1的siRNA基因表達載體治療膿毒癥大鼠。研究結果顯示，模型高、中、低濃度組能夠顯著降低膿毒癥大鼠肝肺組織中TNF-α、IL-6的表達，上調其抗炎細胞因子IL-10的表達，顯著提高了膿毒癥大鼠的存活率，并且高濃度組治療作用優于中濃度組和低濃度組。

綜上所述，殼聚糖納米粒聯合基因治療技術治療膿毒癥，符合現代醫學的研究方向和特點，有望形成制備新的基因藥物的治療體系，可提高膿毒癥患者的生存率以及對預后帶來巨大收益。

[1] 盛志勇，姚詠明.膿毒癥與多器官功能障礙綜合征[J].中華急診醫學雜志，2003，12(10)：653-654.

[2] 王麗亞，郝娜，劉亢丁.納米技術在臨床醫學中的應用現狀和展望[J].中風與神經疾病雜志，2013，30(8)：764-765.

[3] Deitch EA.Multiple organ failure: pathophysiology and potential future therapy[J].Ann Surg,1992,216(2): 117- 134.

[4] 孟憲鈞.肝臟在多器官功能衰竭發生中的作用[J].中華醫學雜志，1988，6(8)：191-193.

[5] 吳榮謙，宋旭華，徐迎新，等.促炎癥和抗炎癥細胞因子基因表達與膿毒癥小鼠肝損傷的關系[J].中華普通外科雜志，2001，16(2)：103-105.

[6] 姚詠明，盛志勇，林洪遠，等.膿毒癥定義及診斷的新認識[J].中國危重病急救醫學，2004，16(6)：321-324.

[7] Annane D,Bellissant E.Cavaill on JM1Sep tic shock[J].Lancet,2005, 365 (9453): 63-78.

[8] Pachot A,Monneret G,Voirin N,et al.Longitudinal study of cytokine and immune transcription factor mRNA expression in septic shock[J].Clinical Immunology,2005,114 (1): 61-69.

[9] Gogos CA,Drosou E,Bassaris HP,et al.Pro-versus anti-inflammatory cytokine profile in patients with severe sepsis: a marker for prognosis and future therapeutic options[J].J Infec Dis,2000,181(1): 176-1801.

[10] 韓濤，鄧勇，樊海寧.膿毒血癥與細胞因子研究進展[J].中國現代醫藥雜志，2011，13(7)：116-119.

[11] Van Craynest N,Santaella C,Boussif O,et al.Polycationic telomers and cotelomers for gene transfer: synthesis and evaluation of their an vitro transfection efficiency[J].Bioconjug Chem，2002,13(1):59-75.

[12] Jackson DA,Juranek S,Lipps HJ.Designing nonviral vectors for efficient gene transfer and long-term gene expression[J].Mol Ther,2006，14(5):6136-26.

[13] Mansouri S,Lavigne P,Corsi K,et al.Chitosan-DNA nanoparticles as non-viral vectors in gene therapy: strategies to improve transfection efficacy[J].Eur J Pharm Biopharm,2004,57(1):1-8.

[14] Boerma EC.The microcirculation as a clinical concept:work in progress[J].Curr Opin Crit Care,2009,15(3):261-265.

[15] Balestra GM,Legrand M,Ince C.Microcirculation and mitochondria in sepsis:getting out of breath[J].Curr Opin Anaeesthesiol,2009,22(2):184-190.

(編校：吳茜)

Effect of chitosan mediated HMGB1 siRNA on cytokines in liver and pulmonary of sepsis rat

ZHOU Kai1,HU Ying-chun2

(Department of Emergency, Affiliated Hospital of Luzhou Medical College, Luzhou 646000, China)

ObjectiveTo observe the effect of chitosan nanoparticles mediated HMGB1 siRNA gene expression vector in treatment of sepsis rats, in order to provide clinical application experiment foundation and provide theoretical evidence for gene drugs.Methods60 male SD rats were divided into 5 groups：normal group，negative group，model low concentration group，model moderate concentration group，model high concentration group，each had 12 rats.Except normal group，the other groups were made the cecum ligation perforation technique (CLP) to cause sepsis，and different concentration of chitosan-pGENESIL-HMGB1 hybrid particles were injected into the caudal vein of rats.Normal group were injected with saline and negative group were given nanoparticles.The expression levels of cytokines such as IL-6，IL-10，TNF-α in liver and pulmonary of sepsis rats were detected by ELISA and survival rate of rats were observed.ResultsCompared with normal group，the expression levels of IL-6，TNF-α in liver and pulmonary tissue of negative group increased significantly(P< 0.05)，while the expression levels of IL-10 had no significant difference.The expression levels of IL-6, TNF-α in each treatment group were significantly reduced(P<0.05)，whereas the expression of IL-10 significantly increased(P<0.05).The survival rates of high concentration model group were higher than low concentration model group and moderate concentration model group(P<0.05). ConclusionChitosan nanoparticles combine gene therapy technique can significantly reduce the expression of liver and lung tissue TNF- α and IL-6 in septic rats, upregulation the expression of the anti-inflammatory cytokine IL-10, significantly increased the survival rate of rats with sepsis.It is expected to form the preparation of new gene drug treatment system，and will improve the survival rates of patients with sepsis.

sepsis; gene therapy; nanotechnology; cytokines

四川省衛生廳科研課題(130353)

周凱，男，本科，主治醫師，研究方向：重癥醫學，E-mail：59727372@qq.com。

R459.7

A

1005-1678(2015)01-0077-04