復方鱉甲軟肝方血清防治肝纖維化作用機制的實驗研究

周立文,葛偉偉,張雅麗,胡義揚

(1.海南省瓊中人民醫院 藥劑科，海南 瓊中 572900；2.臺州市中心醫院 骨二科，浙江 臺州 317004；3.上海市中醫藥大學 臨床醫學系，上海 201203)

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復方鱉甲軟肝方血清防治肝纖維化作用機制的實驗研究

周立文1,葛偉偉2,張雅麗2,胡義揚3

(1.海南省瓊中人民醫院 藥劑科，海南 瓊中 572900；2.臺州市中心醫院 骨二科，浙江 臺州 317004；3.上海市中醫藥大學 臨床醫學系，上海 201203)

目的 探討復方鱉甲軟肝方血清防治肝纖維化的作用機制。方法 將45只雄性SD大鼠按照1:1:1的比例隨機均分為正常組、模型組及復方鱉甲軟肝片組(FFBJRGP組)，正常組皮下注射橄欖油3 mL/(kg·d)，并以1g/(kg·d)的劑量灌服蒸餾水，連續6周；模型組皮下注射以橄欖油配制的40%的CCl4構建大鼠肝纖維化模型，并以1 g/(kg·d)的劑量灌服蒸餾水，連續6周；FFBJRGP組皮下注射以橄欖油配制的40%CCl4，3 mL/(kg·d)，并以1g/(kg·d)的劑量灌服復方鱉甲軟肝片，連續6周。比較3組血清相關指標、環氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)mRNA、COX-2蛋白、鼠抗α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)、血栓烷B2(TXB2)、6-酮-前列腺素F1α(6-K-PGF1α)及TXB2/6-K-PGF1α水平。結果 模型組與FFBJRGP組總蛋白、AST及ALT水平均顯著高于正常組(P<0.05)，白蛋白水平均顯著低于正常組(P<0.05)；FFBJRGP組總蛋白、AST及ALT水平均顯著低于模型組(P<0.05)，白蛋白水平顯著高于模型組(P<0.05)。模型組與FFBJRGP組COX-2mRNA、COX-2蛋白、α-SMA評分均顯著高于正常組(P<0.05)，FFBJRGP組上述指標評分均顯著低于模型組(P<0.05)。正常組與FFBJRGP組TXB2、TXB2/6-K-PGF1α水平均顯著小于模型組(P<0.05)，3組6-K-PGF1α水平差異無統計學意義。結論 復方鱉甲軟肝方可有效改善肝纖維化大鼠肝功能，其通過降低肝纖維化大鼠COX-2水平可能是其防治肝纖維化的作用機制之一。

復方鱉甲軟肝方；肝纖維化；環氧合酶-2；肝功能；大鼠

肝纖維化(hepatic fibrosis，HF)是由各種肝損傷因素引起的肝內彌漫性細胞外基質(extracellular matrix，ECM)成分過度沉積的一種病理過程，是肝硬化的前期階段[1]。新近研究表明[2-3]，環氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)在慢性肝炎、肝纖維化以及肝硬化甚至肝細胞癌變等的發生與發展過程中扮演著十分重要的角色。基礎試驗研究表明，COX-2介導的炎性反應參與肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)的活化過程并影響肝竇微循環過程，通過多路徑參與到肝纖維化的發生及發展過程中[4-6]。復方鱉甲軟肝片是當前臨床上用于肝病防治的一種常見的中藥制劑，筆者觀察發現，該中藥制劑可顯著改善CCl4誘導肝纖維化大鼠肝組織炎癥程度以及肝纖維化程度，且可以通過對腎素血管緊張素系統的抑制而產生作用。為了更深層次地探討復方鱉甲軟肝片治療肝纖維化的機制，本文基于前期研究，觀察其對肝纖維化大鼠肝組織COX-2水平的影響情況，現將試驗結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 取45只雄性SD大鼠，SPF級，體質量195～220 g，平均(208.28±11.39)g；均購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物合格證號：SCXK(滬)2000A033，品系代碼：101。本實驗遵循《實驗動物保護條例》。

1.2 實驗藥物及試劑 復方鱉甲軟肝片(內蒙古福瑞醫療科技有限公司生產，國藥準字19991011號)，CCl4(南京化學試劑有限公司生產)，兔抗COX-2多克隆抗體(美國Noemarkers公司生產),COX-2 mRNA原位雜交試劑盒、鼠抗α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)單克隆抗體(上海億欣生物科技有限公司生產)，血栓烷B2、6-酮-前列腺素F1α放射免疫試劑盒(北京泰格科信生物科技有限公司生產)，EnVision免疫組化試劑盒(美國DAKO公司生產)。

1.3 動物造模及分組 將45只雄性SD大鼠按照1:1:1的比例隨機地均分為正常組、模型組及復方鱉甲軟肝片組，每組均為15只。各組大鼠處理情況：正常組皮下注射橄欖油，3 mL/(kg·d)，并以1 g/(kg·d)的劑量灌服蒸餾水，連續6周；模型組皮下注射以橄欖油配制的40%的CCl4構建大鼠肝纖維化模型，并以1g/(kg·d)的劑量灌服蒸餾水，連續6周；FFBJRGP組皮下注射以橄欖油配制的40%CCl4，3 mL/(kg·d)，并以1g/(kg·d)的劑量灌服復方鱉甲軟肝片，連續6周。3組大鼠均自由飲水以及標準飼料喂養。末次給藥第2天于空腹狀態下進行麻醉，并處死，然后取部分肝組織采用濃度為4%的多聚甲醛進行固定，用石蠟進行常規包埋，并免疫組化觀察。部分肝組織加入9:1的無水乙醇研磨之后用0.9%的生理鹽水制成勻漿，于4 ℃條件下離心取上清液，用于檢測TXB2以及6-K-PGF1α。

1.4 觀察指標

1.4.1 血清相關指標：實驗前，大鼠應禁食12h。稱重之后采用濃度為10%的水合氯醛進行麻醉(給藥劑量為4 mL/kg)，腹主動脈取血，靜置1 h之后，于3000 r/min的轉速調節下離心20 min，然后分離血清，采用全自動生化分析儀對血清中總蛋白、白蛋白、AST及ALT水平進行檢測分析。

1.4.2 COX-2mRNA檢測：采用原位雜交方法進行檢測[7]，評定標準：陽性染色主要表現為細胞漿著色。

1.4.3 COX-2蛋白檢測：采用免疫組化法進行檢測，試劑盒購自中杉金橋，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。評定標準：陽性染色主要表現為細胞漿及細胞膜呈棕黃色著色。

1.4.4 α-SMA檢測：采用免疫組化法進行檢測，陽性表達主要為細胞漿呈棕黃色。陽性強度判定標準：不著色者為0分，著色淡者為1分，中等著色者為2分，著色較深者為3分；著色細胞陽性范圍為：無著色為0分，著色陽性細胞小于1/3者為1分，著色陽性細胞1/3～1/2為2分，著色陽性細胞>1/2者為3分。將每張切片著色程度與著色細胞陽性范圍得分各自加和，為最終得分[7-8]。

2 結果

2.1 各組大鼠血清相關指標水平對比 模型組與FFBJRGP組總蛋白、AST及ALT水平均顯著高于正常組(P<0.05)，白蛋白水平均顯著低于正常組(P<0.05)；FFBJRGP組總蛋白、AST及ALT水平均顯著低于模型組(P<0.05)，白蛋白水平顯著高于模型組(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠血清相關指標水平比較±s)

*P<0.05，與正常組比較，compared with control group；#P<0.05，與模型組比較，compared with model group

2.2 各組大鼠肝組織COX-2mRNA、COX-2蛋白及α-SMA蛋白評分對比 模型組與FFBJRGP組COX-2mRNA、COX-2蛋白、α-SMA評分均顯著高于正常組(P<0.05)，FFBJRGP組上述指標評分均顯著低于模型組(P<0.05，見表2)。

表2 各組大鼠肝組織COX-2mRNA、COX-2蛋白及α-SMA蛋白評分比較，分)

*P<0.05，與正常組比較，compared with control group；#P<0.05，與模型組比較，compared with model group

2.3 各組大鼠肝組織TXB2、6-K-PGF1α及TXB2/6-K-PGF1α水平對比 正常組與FFBJRGP組TXB2、TXB2/6-K-PGF1α水平均顯著小于模型組(P<0.05)，3組6-K-PGF1α水平差異無統計學意義(見表3)。

表3 各組大鼠肝組織TXB2、6-K-PGF1α及TXB2/6-K-PGF1α水平比較

*P<0.05，與正常組比較，compared with control group；#P<0.05，與模型組比較，compared with model group

3 討論

肝纖維化主要病理特征為ECM過度沉積、肝竇毛細血管化以及竇周纖維化，屬于一個非常復雜的發展過程[8]。大量臨床研究證實[9-10]，復方鱉甲軟肝片能夠有效控制該過程的進展。中藥抗肝纖維化的作用是多元及多靶點的，這是由于中藥不同組分可以針對不同的病理環節來發揮調節功能。到目前為止，我國多家醫療機構采用現代醫學以及生物學的方法探討多種防治肝纖維化的中藥，包括：清熱利濕方、益氣活血方、疏肝健脾方、活血滲濕方以及軟堅散結方等藥劑。根據陳磊等研究證實[11]，復方中藥抗纖維化的藥理作用主要包括護肝、活血化瘀、改善微循環、抑制HSC活化、促進ECM的降解以及促進HSC凋亡等。本研究主要采用內蒙古福瑞醫療科技有限公司生產的中藥制劑復方鱉甲軟肝片防治肝纖維化，主要對其防治肝纖維化的機制進行探討。

3.1 復方鱉甲軟肝片的組方依據 中醫認為，肝藏血、主疏泄以及體陰而用陽，此特性不僅確保了機體正常的氣機升降以及血運情況，而且還可稱為淤血形成的生理學基礎[12-13]。在慢性肝病的演變過程之中，濕熱邪毒為一個十分重要的致病源，而血瘀則是其主要病理產物。復方鱉甲軟肝片主要由鱉甲、三七、赤芍、冬蟲夏草、連翹及板藍根等組成，具有益氣養血、化瘀解毒以及軟堅散結等功效，是治療肝纖維化的中成藥。該中成藥治療肝纖維化的機制主要包括[14]：減少肝內組織基質金屬蛋白酶抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinases,TIMPs)的表達，進而使得基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)的生物活性顯著增強，并從基因轉錄水平上誘導多種MMPs的生成，從而達到降解過度沉積的ECM及軟化肝臟之目的；明顯抑制HSC活化、增殖的功能，促進活化HSC的凋亡從而減少ECM的產生，因此有阻止慢性肝病肝纖維化的發生和進展之作用。慢肝解郁膠囊由柴胡、白芍、茯苓、白術等藥物組成，具有疏肝解郁、健脾養血之功。用于遷延性肝炎或慢性肝炎的治療，在緩解肝區脹痛、胸悶不舒、食欲不振、腹脹等癥狀方面療效顯著。

3.2 復方鱉甲軟肝片對肝纖維化大鼠肝功能的影響 血清中轉氨酶水平的高低能夠很好地間接反映干細胞受損程度，是臨床肝病診斷中非常重要的一種生化指標。已有大量臨床研究證實，肝纖維化患者血清中AST水平呈顯著上升的變化趨勢，主要表現為AST/ALT大于2[15]。本研究發現，復方鱉甲軟肝片可顯著降低大鼠血清中AST及ALT水平，且使2者水平恢復至正常水平。同時，復方鱉甲軟肝片可使得血清中總蛋白及白蛋白水平升高，且與正常水平相接近。本研究結果顯示，該藥物組分具有護肝、修復肝細胞受損以及降低轉氨酶活性等藥理功能。

3.3 復方鱉甲軟肝片防治肝纖維化的作用機制 COX-2屬于前列腺素(prostaglandin,PG)合成酶的一種亞型，同時也屬于血栓素A2(thromboxane,TXA2)的限速酶。主要在炎性因子及細胞因子的刺激條件下高水平表達，然后促使PG的合成，后者則可直接使得微血管循環發生障礙而致使血管內皮受損，通透性增大，白細胞從血循環滲出，啟動炎癥的級聯反應，從而參與到多種細胞以及組織的炎性反應過程中。當各種致病因素導致肝臟受損時，Kupffer細胞被激活而產生TNF-α、IL-1、IL-6等大量的細胞因子，上述細胞因子能夠誘導COX-2的表達及PG的生成，從而參與到肝臟的炎性損傷過程[16]。作為前炎癥介質的PGE2與TXB2促進炎癥細胞發生浸潤作用，同時還能夠對NF-κB的水平起到調節作用，其又可以通過增強炎性細胞因子TNF-α、IL-18、IL-1以及干擾素γ等的轉錄上調COX-2的表達水平，從而形成一種正反饋環路，擴大炎性反應范圍，使得炎癥過程明顯延長，最終產生更嚴重的肝受損。COX-2介導的炎性反應還參與到HSC的活化過程以及對肝竇微循環存在一定的影響，通過多條路徑參與到肝纖維化的發生及發展過程之中。相關臨床研究證實，CCl4所導致的慢性肝損傷大鼠的進展過程中COX-2水平顯著上升[16]。國內研究者證實[17]，CCl4誘導肝硬化大鼠模型TXB2及PGE2較正常組顯著上升，應用COX-2抑制劑后兩者水平均顯著下降且TXB2在調節門脈壓力方面發揮著極為重要的作用。國外一項研究[18]表明，慢性肝炎以及肝硬化患者的肝組織中COX-2水平隨著肝纖維化的嚴重程度的增大而增加。應用COX-2抑制劑能夠對炎癥介質進行抑制，減少HSC活化以及膠原的產生，具有非常明顯地抗纖維化功能。本研究結果顯示，模型組與FFBJRGP組COX-2mRNA、COX-2蛋白、α-SMA評分均顯著高于正常組(P<0.05)，FFBJRGP組上述指標評分均顯著低于模型組(P<0.05)，此結果提示COX-2可能參與CCl4肝纖維化的發生、發展過程。此外，正常組與FFBJRGP組TXB2、TXB2/6-K-PGF1α水平均顯著小于模型組(P<0.05)，3組6-K-PGF1α水平差異無統計學意義。

綜上所述，復方鱉甲軟肝方可有效改善肝纖維化大鼠肝功能，其通過降低肝纖維化大鼠COX-2水平可能是其防治肝纖維化的作用機制之一。

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(編校：王儼儼，吳茜)

Experimental study on role of Fufangbiejiaruanganfang in serum prevention and controlling of liver fibrosis and its mechanism

ZHOU Li-wen1,GE Wei-wei2,ZHANG Ya-li2,HU Yi-yang3

(1.Department of Pharmacy, People’s Hospital of Qiongzhong, Qiongzhong 572900, China; 2.Department of Second Orthopedics,Taizhou Central Hospital, Taizhou 317004, China; 3.Department of Clinical Medicine, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China)

ObjectiveTo explore the role of Fufangbiejiaruanganfang in serum prevention and controlling of the liver fibrosis and its mechanism.Methods45 male SD rats were randomly divided into normal group, model group and Fufangbiejiaruanganpian group (FFBJRGP group) by proportion of 1:1:1, and normal group were injected olive oil, 3 mL/(kg·d), and distilled water of 1 g/(kg·d) were gavaged for 6 weeks; the model group were subcutaneously injected with 40% CCl4prepared by olive oil 3 mL/(kg·d) to construct the model of liver fibrosis in rats, and distilled water of 1g/(kg·d) were gavaged for 6 weeks; FFBJRGP group were injected with 40%CCl4prepared by olive oil 3 mL/(kg·d), and Fufangbiejiaruanganpian of 1 g/(kg·d) were gavaged for 6 consecutive weeks.Related indexes, serum COX-2mRNA, COX-2 protein, α-SMA, TXB2, 6-K-PGF1αand TXB2/6-K-PGF1αlevels were compared among the three groups.ResultsTotal protein, AST and ALT levels in model group and FFBJRGP group were significantly higher than those in normal group (P< 0.05), albumin levels were significantly lower than that in normal group (P< 0.05); total protein, AST and ALT levels in FFBJRGP group were significantly lower than those in model group (P< 0.05), albumin level was significantly higher than that in model group (P<0.05).COX-2 mRNA, COX-2 protein, α-SMA scores in model group and FFBJRGP group were significantly higher than those in normal group (P<0.05), the above scores in FFBJRGP group were significantly lower than those in model group (P<0.05).The levels of TXB2and TXB2/6-K-PGF1αin normal group and FFBJRGP group were significantly lower than those in model group (P< 0.05), there were no statistically significant differences of 6-K-PGF1αlevels in three groups. ConclusionFufangbiejiaruanganfang could effectively improve hepatic function in rats with hepatic fibrosis, reduce the level of COX-2 in rat liver fibrosis may be one of mechanisms on prevention and treatment of liver fibrosis.

Fufangbiejiaruanganfang; liver fibrosis; cyclooxygenase -2; liver function; rats

國家自然科學基金(30973924/H2814)

周立文，男，本科，副主任藥師，藥劑科主任，研究方向：醫院藥學，E-mail：qch1821460050@163.com。

R575

A

1005-1678(2015)01-0060-04